Динамика показателей лазерной спекл-визуализации кровотока в тканях при временной частичной локальной ишемии поджелудочной железы у голодных, сытых и алкоголизмрованных крыс

• ¹ В ведение. На развитие деструкции поджелудочной железы оказывают влияние множество факторов, но наиболее значимым является нарушение микрогемодинамики [1, 2]. Ишемия и реперфузия в тканях поджелудочной железы экспериментальных животных приводят к изменениям, характерным для острого панкреатита [3]. В настоящее время наиболее эффективными методами определения параметров микрогемодинамики считаются лазерная допплеровская фло-уметрия (ЛДФ) и спекл-визуализация [4–9].

Цель: установить влияние частичной временной ишемии и последующей реперфузии на развитие панкреатита у лабораторных крыс.

Задачи исследования:

• 1.    Оценить возможность использования методов лазерной спекл-визуализации для контроля за степенью сокращения кровотока в сосудах поджелудочной железы при создании локальной ишемии путем компрессии магистральных сосудов.

• 2.    Изучить различия динамики восстановленного кровотока в микрососудах поджелудочной железы сытых, голодных и алкоголизированных крыс в различные сроки после локальной пяти- и двадцатиминутной ишемии, вызванной путем сокращения кровотока на 50%.

Материал и методы. Эксперименты выполнены на 73 белых крысах линии Wistar массой 200–250 г. Все манипуляции на животных проведены в строгом соответствии с Правилами проведения качественных клинических испытаний в РФ (утв. МЗ РФ и введ. в действие 1 янв. 1999 г.), приложением 3 к приказу МЗ СССР №755 от 10 августа 1977 г., положениями Хельсинкской декларации (2000 г.) и рекомендациями, содержащимися в Директивах Европейского Сообщества (№86/609ЕС).

Исследование свойств кровотока производилось с помощью методов лазерной допплеровской флоуметрии, цифровой биомикроскопии и метода лазерной спекл-контрастной визуализации по методике, используемой на кафедре оптики и биофотоники ФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского» и подробно описанной в нашей публикации 2014 г. [10]. Спекл-контрастная визуализация — бесконтактный метод, позволяющий получать и анализировать изображения кровотока в режиме реального времени. Регистрируемое значение контраста спекл-изображений обратно пропорционально скорости кровотока. Чем больше скорость, тем меньше контраст и наоборот.

В 2015 г. изменена конфигурация установки (схема без использования оптического волокна для доставки лазерного излучения к исследуемой области (рис. 1)). Исследовались сосуды поджелудочной железы, диаметры которых составили 280±40 мкм, что превышает диаметры сосудов в прошлых исследованиях. В связи с этим в серии экспериментов 2015 г. значения спеклов в контрольных группах крыс несколько ниже, чем в эксперименте 2014 г.

Лабораторные крысы были разделены на 8 групп.

В первой группе (n=6) исследовали исходный кровоток и его значения через 5 минут и на 5-е сутки после начала опыта.

Во второй группе (n=6) изучали исходный кровоток и его значения через 20 минут и на 5-е сутки после первого эксперимента.

Рис. 1. Схема экспериментальной установки: 1 — He-Ne лазер ГН-5П, длина волны –633 нм; 2 — детектор (КМОП камера Basler A602f) с закрепленным тубусом микроскопа с микрообъективом (Ломо, 10×); 3 — расширитель лазерного пучка объектив 10х; 4 — исследуемый объект

В третьей группе (n=11) исследовали исходный кровоток голодных крыс, его значения через 5 минут после 50% сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы, а также на 5-е сутки после начала опыта.

У четвертой группы (n=10) определялся исходный кровоток голодных крыс, его значения через 20 минут от начала частичной локальной ишемии тканей поджелудочной железы, а также на 5-е сутки после начала опыта.

В пятой группе (n=10) исследовали исходный кровоток сытых крыс, его значения через 5 минут от начала частичной локальной ишемии, а также на 5-е сутки после начала опыта.

В шестой группе (n=10) изучали исходный кровоток сытых крыс, его значения через 20 минут после 50% сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы и на 5-е сутки после начала опыта.

В седьмой группе (n=10) определяли исходный кровоток алкоголизированных крыс, его значения через 5 минут, а также на 5-е сутки после частичной ишемии поджелудочной железы.

В восьмой группе (n=10) исследовали исходный кровоток алкоголизированных крыс, его значения через 20 минут от начала частичной локальной ишемии, а также на 5-е сутки после начала опыта.

Статистический анализ проведен с использованием пакета программ Statsoft (США). Данные представлены как mean±SD (или medain, 25-75%-ный интерквартильный размах при распределении признака, отличном от нормального). Для оценки различий частоты признака в группах использован критерий χ². Достоверность различий количественных показателей между несвязанными группами определялась при помощи непарного t-критерия Стьюдента и критерия Манна — Уитни. Статистически значимыми считались различия при p<0,05.

Результаты. Результаты измерений усредненного по времени контраста спеклов в контрольных группах животных представлены в таблице. Наблюдается статистически не значимое нарастание контраста спеклов как реакция на извлечение органа из брюшной полости во внешнюю среду.

Показатели усредненного по времени контраста спеклов (V) в контрольных группах животных

Группы	без воздействия	через 5 мин	через 20 мин	через 1 день	через 5 дней
Первая группа сравнения (n=6) Вторая группа сравнения (n=6)	0,162±0,031 0,164±0,029	0,181±0,021 0,183±0,022	0,182±0,012 0,183±0,014	0,180±0,021	0,167±0,019

Рис. 3. Cравнительная динамика показателей усредненного по времени контраста спеклов (V) и соответствующая ему скорость кровотока, отличающиеся у сытых, голодных и алкоголизированных крыс до, во время, после 20-минутной ишемии и на 5-й день после 50%-ного сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы

Рис. 2. Cравнительная динамика показателей усредненного по времени контраста спеклов (V) и соответствующая ему скорость кровотока, отличающиеся у сытых, голодных и алкоголизированных крыс до, во время, после 5-минутной ишемии и на 5-й день после 50%-ного сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы

На рис. 2 и 3 наглядно представлена сравнительная динамика показателей усредненного по времени контраста спеклов и соответствующей ему скорости кровотока голодных, алкоголизированных и сытых крыс до, во время, после пяти- и двадцатиминутной ишемии и на 5-й день после эксперимента соответственно. При этом исходные значения контраста спеклов у алкоголизированных крыс ниже значений у голодных крыс (р<0,049).

Определяется разница между значениями контраста спеклов алкоголизированных и сытых крыс, а также группами голодных и сытых крыс, но она не достигает статистической значимости.

Вектор направленности реперфузионных изменений отличается в зависимости от продолжительности ишемии поджелудочной железы.

Выраженность реперфузионного синдрома отличается у сытых, голодных и алкоголизированных крыс. После прекращения частичной ишемизации поджелудочной железы длительностью 5 минут значения контраста спеклов статистически значимо меньше исходных, а следовательно, относительная скорость кровотока больше исходной, что свидетельствует о развитии реактивной гиперемии в органе при реперфузии. В большей степени это выражено в группе алкоголизированных животных. После прекращения частичной ишемизации поджелудочной железы длительностью 20 мин значения контраста спеклов останавливаются на исходных уровнях, что соответствует отсутствию реактивной гиперемии. При этом треть животных погибает в первые 5 суток от начала опыта.

Большая часть (80%) погибших животных представлена группой крыс, подвергшихся алкоголизации.

Обсуждение. Лазерная спекл-визуализация и прижизненная цифровая микроскопия являются эффективными методами мониторинга микрогемодинамики поджелудочной железы.

Контраст усредненных по времени динамических спеклов, используемый в качестве диагностического параметра, характеризуется достаточно высокой

c)                                        d)

Рис. 4. Изображение сосуда поджелудочной железы (диаметр 280 мкм) в когерентном свете (630 нм) (ч-б) и рассчитанное распределение контраста спеклов (1-0) (цветной) в различных состояниях скорости кровотока: a) нормальное, b) 50%-ная ишемия, c) 100%-ная ишемия, d) реперфузия чувствительностью к изменениям кровотока в органе и может эффективно использоваться для дальнейших исследований в этой области.

Методики лазерной спекл-визуализации и прижизненной цифровой микроскопии позволяют контролировать степень сокращения кровотока в сосудах поджелудочной железы при создании локальной ишемии путем компрессии магистральных сосудов. На рис. 4 представлено спекл-изображение сосуда поджелудочной железы при различных состояниях скорости кровотока.

После пятиминутного сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы на 50% возникает реактивная гиперемия, клинические и морфологические изменения носят обратимый характер.

После двадцатиминутного сокращения кровотока на 50% реактивной гиперемии нет, клинически и морфологически развивается панкреатит, не достигающий степени панкреонекроза. При этом треть животных погибают в первые 5 суток от начала опыта. Большая часть (80%) погибших животных представлена группой крыс, подвергшихся алкоголизации.

Поджелудочная железа у алкоголизированных крыс более чувствительна к ишемии, чем у групп сытых и голодных крыс.

Заключение. Методами лазерной спекл-визуализации и прижизненной цифровой микроскопии после пяти- и двадцатиминутной частичной ишемии поджелудочной железы выявлены фазные разнонаправленные изменения перфузии ее тканей и разная степень тяжести постишемического панкреатита.

Требуется дальнейшее изучение влияния реперфузионных процессов на возникновение хирургической патологии в поджелудочной железе.