Динамика содержания азотистых веществ и липидов в хвое интродуцированных видов Picea а. Dietr. в таежной зоне (Карелия)

Известно, что большинство аборигенных видов древесных растений таежной зоны России плохо переносят прогрессирующее загрязнение окружа- ющей среды. Между тем виды хвойных растений других географических районов, в том числе и рода Picea, устойчивы к загазованности и задымленности, долговечны и весьма декоративны в течение всего года [Встовская, 1983; Плотникова, 1988]. Кроме того, многие из них отличаются значитель-

но большей продуктивностью, чем местные виды, и нередко способны к натурализации [Калуцкий, Болотов, 1983; Мамаев, Махиев, 1996]. Повышение биологического разнообразия естественных и искусственных фитоценозов, по мнению ряда исследователей [Мамаев, Махиев, 1996; Буданцев, 1999], возможно только через интродукцию древесных растений. Все это свидетельствует о необходимости интродукции хвойных и оценки их перспективности. Последняя может быть установлена лишь на основе всестороннего изучения адаптаций, происходящих у испытуемых растений в новых условиях произрастания [Ворошилов, 1960; Базилевская, 1964].

В Карелии основным экологическим фактором, лимитирующим рост и развитие растений, является низкая температура воздуха в зимний период. Исследованиями многих авторов [Новицкая, 1971; Сергеева, 1971; Туманов, 1979; Петухова, 1981; Трунова, 1990; Kontunen-Soppela, Laine, 2001; Welling, Palva, 2006; Kargiotidou, Deli, Galan-opoulou, 2008; Семенова и др., 2017; Нохсоров, Дударева, Петров, 2019] показано, что устойчивость растений к низким температурам обеспечивается их подготовкой к периоду глубокого покоя, которая состоит в специальных физиологических и цитологических перестройках. Известно, что у многолетних растений, в том числе и древесных, при подготовке к периоду глубокого покоя идет дополнительный синтез белков и других высокомолекулярных веществ. Это способствует созданию структуры протоплазмы клеток, повышающей устойчивость растительных организмов к неблагоприятным факторам среды, и в частности, к отрицательным зимним температурам [Сергеев, Сергеева, 1977; Трунова, 1984, 1990; Drossopoulos, Ni-avis, 1988; Kontunen-Soppela, Laine, 2001; Welling, Palva, 2006; Kargiotidou, Deli, Galanopoulou, 2008]. Аминокислоты представляют собой физиологически наиболее важную группу азотистых соединений, участвующих в синтезе различных веществ:

структурных белков, ферментов, нуклеиновых и органических кислот, сложных углеводов, жиров и др. [Кретович, 1980; Kontunen-Soppela, Laine, 2001; Welling, Palva, 2006; Kargiotidou, Deli, Galanopoulou, 2008; Fowden, 2015]. Поэтому аминокислоты прямо или косвенно связаны с биохимизмом ростовых процессов. Кроме того, их содержание является динамичным показателем, изменяющимся под действием различных факторов среды, в том числе и низких температур [Савицкая, 1965; Спирин, Гаврилова, 1967; Durzan, 1968; Брянцева, 1973; Pietiliänen, Lähdesmäki, 1986]. Важная роль в процессах адаптации древесных растений к отрицательным температурам принадлежит мембранной фракции липидов – фосфолипидам. Показано, что накопление фосфолипидов в хвое Рicea fennica в осенний период связано с новообразованием фосфолипидных мембран эндоплазматического ретикулума, диктиосом, и увеличением крист митохондрий [Родионов и др., 1983; Kontunen-Soppela, Laine, 2001; Welling, Palva, 2006; Kargiotidou, Deli, Galanopoulou, 2008]. Перестройка ультраструктуры клеток хвои осенью и связанное с ней накопление фосфолипидов являются важным условием высокой морозоустойчивости хвои. Состав азотистых веществ и липидов в хвое интродуцированных в Карелии видов до сих пор не изучался.

Цель исследований – определить устойчивость интродуцированных видов рода Picea к низкой температуре воздуха по динамике азотистых веществ и липидов в хвое.

Материалы и методы исследований

Исследования проводились в Ботаническом саду Петрозаводского государственного университета, расположенного в таежной зоне. Объектами служили аборигенный и 5 интродуцированных видов рода Picea (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика объектов исследований

Таксон	Место происхождения саженцев (ботсад–город)	Средний возраст, лет	Средняя высота, м	Наличие семе-ношения
Picea fennica (Regel) Кom.	Петрозаводск	19	5.8	Нет
P. fennica (Regel) Кom.	Петрозаводск	50	16.0	Есть
P. pungens Engelm. f. glauca Regel	С.–Петербург	36	12.7	Есть
P. pungens Engelm. f. viridis Regel	С.–Петербург	36	10.7	Есть
P. glauca (Mill.) Britt.	С.–Петербург	33	11.2	Есть
P. omorica (Pane) Purk.	Бухарест	27	5.7	Нет
P. mariana Britt.	Бухарест	19	4.7	Нет
P. obovata Ledeb.	Минск	23	6.4	Нет

Для проведения биохимического анализа отби-   каждого вида из средней части кроны с разных рали однолетнюю хвою с нескольких деревьев   сторон 4 раза в год (2002–2003 гг.) в периоды

набухания вегетативных почек (май), интенсивного роста побегов (конец июня), перехода к глубокому покою (середина сентября), глубокого покоя (конец октября). Результаты проведенных ранее исследований [Кищенко, 2000] показали, что различия в сроках прохождения указанных фенофаз у изучаемых видов не превышают 1 недели, в связи с чем одновременное взятие образцов представлялось вполне корректным.

Содержание белков в свежем материале устанавливали по методу Г.А. Бузуна, К.М. Джемухад-зе, Л.Ф. Милешко [1982] с применением красителя амидочерный 10. Извлечение аминокислот из растительного материала проводили по методике Б.П. Плешкова [1976], состав и содержание аминокислот определяли на автоматических аминокислотных анализаторах ААА–339 и ААА–881, отсчет аминограмм – на персональном компьютере. Липиды экстрагировали смесью хлороформа и метанола [Родионов, 1979]. Для выделения фракций фосфолипидов с целью изучения их жирнокислотного состава использовали метод тонкослойной хромотографии. Состав жирных кислот определяли газохроматографическим методом [Родионов, Захарова, 1979]. Хроматограммы регистрировали на измерительно-вычислительном комплексе ВК–1 и обсчитывали на ЭВМ. Образцы хвои для определения изоферментного состава пероксидазы замораживали жидким азотом и измельчали на электрической мельнице. Экстракцию ферментов из растительного материала проводили в трис-глициновом буфере (рН 8.3), содержащем 0.1 ЭДТ 1% тритона Х–100 [Ларионова, 1979]. Для очистки белков от фенолов применяли ионообменную смолу Дауэкс 1 x 8 (200-400 меш). Экстракцию вели в течение 1 ч. в холодильнике. Разделение изоферментов осуществляли методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле [Сафонов, Сафонова, 1969]. Окраску на геле зон с ферментативной активностью производили по В.И. Сафонову и М.П. Сафоновой [1979]. В качестве субстрата для пероксидазы использовали бензидин. Подвижность отдельных изоформ в электрическом поле, измеряемой величиной ОЭП (относительная электрофоретическая подвижность), рассчитывали путем деления расстояния, пройденного данной фракцией, на расстояние от старта до финиша, пройденное красителем-метчиком (бромфенол синий) [Садва-касова, Кунаева, 1987].

Результаты и их обсуждение

Азотистые вещества. Результаты биохимических исследований показали, что заметное повышение содержания азотистых веществ в хвое изученных видов рода Picea происходит при переходе растений из фазы активного роста побегов к пери- оду глубокого покоя (табл. 2). У аборигенного вида (Р. fennica) количество азотистых веществ в хвое увеличивается при этом в 3–4 раза, а у интродуцированных видов – в 3.5–5 раз. Наиболее высокий уровень белков в хвое отмечается у P. mariana, а наиболее низкий – у P. glauca.

У Р. fennica , P. omorica и P. obovata усиление синтеза азотистых веществ к периоду глубокого покоя сопровождается вначале некоторым снижением уровня свободных аминокислот, а затем их возрастанием. У изучаемых интродуцированных видов (кроме P. omorica ) в этот период наблюдается снижение концентрации свободных аминокислот. У P. mariana высокий уровень аминокислот отмечается в период набухания почек; к фазе интенсивного роста побегов он резко снижается (почти в 5 раз), а затем вновь возрастает к наступлению периода глубокого покоя (табл. 2). По нашим данным, только у двух изученных видов ( Р. fennica, P. omorica ) свободные аминокислоты, обеспечив синтез значительного количества белков, сами накапливаются к периоду глубокого покоя. При качественном анализе аминокислот выяснили, что большую их часть составляют глутаминовая, γ-аминомаслянная, аспарагиновая кислоты, пролин, аргинин, аланин, этаноламин (всего 19 аминокислот).

В период набухания почек у 50-летней Р. fennica и у P. mariana – более половины, а у других видов – около трети общего количества свободных аминокислот составляет глутаминовая кислота. Во время вегетации ее процент несколько снижается, а при переходе к покою он падает. Исключение составляет P. omorica, у которой процентное содержание глутаминовой кислоты возрастает в период подготовки к глубокому покою (табл. 2). Глутаминовая кислота занимает ключевое положение в обмене аминокислот как универсальный донор и акцептор аминогрупп. Она обеспечивает взаимодействие белкового и углеводного обменов, осуществляет ассимиляцию азота, его транспорт и запасание [Измайлов, Смирнов, 1977]. В процессе подготовки к росту глутаминовая кислота накапливается в хвое в свободном состоянии в больших количествах. Образование ее происходит в хлоропластах и митохондриях. В процессе роста новых побегов расход глутаминовой кислоты идет активней ее синтеза, а при переходе древесного растения к зимнему покою новообразование кислоты параллельно со снижением активности фотосинтеза еще больше тормозится, зато увеличивается ее участие в образовании белковых структур, играющих защитную функцию в неблагоприятных условиях зимы; γ-аминомасляная кислота является продуктом декарбоксилирования глутаминовой кислоты [Измайлов, Смирнов, 1977] и может рассматриваться как запасной фонд по- следней ввиду легкости их взаимных превращений [Судачкова, 1977].

Таблица 2

Содержание отдельных свободных аминокислот в хвое видов рода Picea в разные фенофазы,

мкг/г сухого вещества (в скобках - процент от суммы аминокислот)
Таксон	Фенофаза
	набухание почек	рост побегов	подготовка к покою	глубокий покой
Глутаминовая кислота
Р. fennica (19 лет)	603 (35)	203 (22)	118 (14)	153 (13)
Р. fennica (50 лет)	1352 (52)	776 (36)	311 (27)	252 (12)
P. pungens f. glauca	348 (31)	219 (17)	68 (8)	109 (15)
P. pungens f. viridis	333 (35)	376 (24)	100 (9)	147 (10)
P. glauca	275 (26)	201 (20)	73 (12)	122 (16)
P. mariana	1034 (58)	80 (21)	258 (26)	177 (19)
P. omorica	366 (20)	271 (17)	187 (29)	197 (20)
P. obovata	696 (33)	403 (28)	299 (27)	125 (17)
Y-аминомасляная кислота
Р. fennica (19 лет)	261 (15)	166 (18)	80 (9)	165 (14)
Р. fennica (50 лет)	220 (8)	221 (10)	62 (5)	265 (12)
P. pungens f. glauca	149 (14)	238 (19)	276 (33)	122 (16)
P. pungens f. viridis	103 (11)	331 (21)	160 (15)	399 (28)
P. glauca	265 (25)	251 (25)	48 (8)	99 (13)
P. mariana	145 (8)	99 (26)	76 (8)	171 (18)
P. omorica	139 (8)	319 (20)	44 (7)	171 (18)
Аргинин
Р. fennica (19 лет)	91 (50)	50 (5)	127 (15)	83 (7)
Р. fennica (50 лет)	112 (4)	201 (9)	82 (7)	268 (13)
P. pungens f . glauca	50 (4)	36 (3)	60 (7)	110 (15)
P. pungens f . viridis	30 (3)	28 (2)	173 (16)	191 (13)
P. glauca	50 (5)	37 (4)	86 (14)	85 (11)
P. mariana	50 (3)	42 (4)	52 (5)	127 (13)
P. omorica	25 (1)	114 (7)	43 (7)	45 (5)
P. obovata	294 (14)	235 (16)	166 (15)	114 (16)
Этаноламин
Р. fennica (19 лет)	72 (4)	38 (4)	56 (7)	83 (7)
Р. fennica (50 лет)	74 (3)	32 (2)	61 (5)	130 (6)
P. pungens f . glauca	61 (6)	41 (3)	51 (6)	69 (9)
P. pungens f . viridis	54 (6)	47 (3)	64 (6)	76 (5)
P. glauca	59 (6)	60 (6)	53 (9)	46 (6)
P. mariana	45 (2)	21 (6)	76 (8)	99 (10)
P. omorica	54 (3)	75 (5)	44 (7)	57 (6)
P. obovata	53 (2)	26 (2)	53 (5)	69 (10)

В состав белков она не входит, но является донором аминных групп и углеродного скелета при синтезе белка [Савицкая, 1965]. У P. mariana, P. omorica и P. pungens f. glauca динамика процентного содержания γ-аминомасляной кислоты противоположна изменению процента глутаминовой кислоты в хвое: увеличение доли одной кислоты в сумме аминокислот при переходе из одной фенофазы ели в другую сопровождается снижением доли другой (табл. 2). У всех изучаемых видов, кроме P. omorica и P. obovata, повышается процентное содержание аргинина в хвое к периоду глубокого покоя. По данным С.М. Брея [1986], аргинин является запасной формой азота при перезимовке. Значит, большинство видов рода Picea запасает некоторую часть азота на зиму в виде аминокислоты аргинина. Вместе с аминокислотами на аминокислотном анализаторе обнаружен и аминоспирт этаноламин. Известно, что он входит в состав группы фосфолипидов, называемых кефалинами, которые преобладают в мембранах митохондрий [Кретович, 1980]. Доля этаноламина в сумме аминокислот растет к периоду глубокого покоя в хвое всех изучаемых видов, за исключением P. glauca.

Липиды. Содержание суммарных липидов в хвое в фазу набухания почек более низко у интро-дуцентов по сравнению с местным видом, за исключением P. omorica, которая во все сроки ис- следования отличается высоким уровнем этих соединений (табл. 3). Во время интенсивного роста побегов у интродуцированных видов отмечается незначительное накопление липидных веществ, в то время как у Р. fennica происходит их снижение. Вероятно, характер использования этих высокоэнергетических соединений у разных видов различен, о чем свидетельствует и существенная разница в процессах роста и развития [Кищенко, 1995]. Это прежде всего касается нейтральных липидов, которые составляют основную часть суммарных липидов и содержат ди- и триглицериды, являющиеся предшественниками в синтезе ряда соединений, необходимых для новообразования структур [Jamieson, Reid, 1972]. К периоду глубокого покоя хвоя всех видов рода Picea накапливает липиды.

Результаты наших исследований показали, что в динамике фосфолипидов у исследуемых видов ели прослеживается одна и та же тенденция: к периоду глубокого покоя содержание их повышается. Уровень такого накопления неодинаков у разных видов ели. Минимальный запас фосфолипидов отмечен у Р. fennica и P. оbovatа .

Анализируя в целом данные по динамике некоторых показателей азотного и липидного обменов елей при переходе растений от активного роста к глубокому покою (табл. 3), можно отметить, что у P. fennica значительно повышается содержание белков (в 3–4 раза) и незначительно – суммарных свободных аминокислот у молодой P. fennica (у средневозрастной P. fennica сумма аминокислот не изменяется); несколько возрастает концентрация суммарных липидов и фосфолипидов (соответственно на 25 и 40%). У P. pungens f. viridis, P. omorica и P. obovata заметно повышается содержание белков в хвое (в 2 с лишним раза) при уменьшении суммы свободных аминокислот (почти вдвое); количество суммарных липидов и фосфолипидов увеличивается, причем наиболее заметно (соответственно на 80 и 56%) – у P. pungens f. glauca и f. viridis и P. glauca больше других видов накапливают в хвое белки (в 4.7–5.2 раза) при незначительном снижении концентрации аминокислот, а также суммарные липиды (и фосфолипиды у P. pungens f. viridis). P. mariana отличается от других видов тем, что при переходе к периоду глубокого покоя в ее хвое примерно, в равной степени, повышается количество белков и свободных аминокислот (соответственно в 2.9 и 2.5 раза). Кроме того, происходит незначительное увеличение содержания суммарных липидов при почти неизменном уровне фосфолипидов.

Таблица 3

Отношение содержания вещества в хвое в период глубокого покоя к его содержанию в период интенсивного роста побегов у видов рода Picea

Таксон	Белки	Сумма свободных аминокислот	Суммарные липиды	Фосфолипиды
Р. fennica (19 лет)	3.3	1.3	1.4	1.2
Р. fennica (50 лет)	4.0	1.0	1.2	1.2
P. pungens f. glauca	2.2	0.6	1.8	1.6
P. pungens f. viridis	4.7	0.9	1.3	1.4
P. glauca	5.2	0.8	1.2	0.9
P. mariana	2.9	2.5	1.1	1.0
P. omorica	2.6	0.6	1.0	1.2
P. obovata	2.8	0.5	1.4	1.4

Таким образом, выявлены некоторые тенденции в изменении процентного содержания отдельных аминокислот в хвое разных видов рода Picea при переходе от роста побегов к глубокому покою: наблюдается уменьшение доли глутаминовой кислоты и увеличение доли аргинина и этаноламина в общей сумме аминокислот. Среди изучаемых видов выделяется P. omorica , у которой иначе, чем у других объектов исследования, изменяется процент глутаминовой кислоты и аргинина, и P. glauca , с отличающейся динамикой этаноламина.

Все изученные виды можно условно разделить на следующие три группы по характеру изменения исследуемых показателей метаболизма при переходе дерева от роста к глубокому покою (табл. 2):

• 1    группа – Р. fennica и P. obovata (местные ви-

• ды) – в процессе адаптации к зиме важная роль принадлежит белкам, но участвуют и суммарные липиды, фосфолипиды. Количество свободных аминокислот не уменьшается.

• 2    группа – интродуцированные виды P. pungens f . glauca и f. viridis, P. omorica и P. glauca – в процессе адаптации к зиме велико значение белков, усиленный синтез которых приводит к уменьшению уровня свободных аминокислот. У них в разной степени накапливаются суммарные липиды и фосфолипиды.

• 3    группа – интродуцент P. mariana – усиление синтеза белков не приводит к снижению содержания аминокислот, уровень которых растет почти в той же степени, что и белков. Суммарные липиды и фосфолипиды в процессе адаптации к условиям

зимы, вероятно, играют незначительную роль.

Таким образом, при переходе ели от роста к глубокому покою наибольшее участие в процессах приспособления к перенесению низких температур зимы принимают белковые вещества, в меньшей степени – фосфолипиды. Накопление суммарных липидов может иметь не только защитное значение, но и играть запасающую роль в растении. Липиды - наиболее энергоемкие запасные органические вещества. Сумма свободных аминокислот оказалась показателем, наиболее изменчивым у разных видов Picea : у одних его величина растет при переходе к покою, у других – падает. У большинства видов этого рода к наступлению глубокого покоя увеличивается доля этаноламина и аргинина и уменьшается доля глутаминовой кислоты в общей сумме аминокислот.

Заключение

Проведенные исследования позволили установить, что в процессе адаптации интродуцированных видов рода Picea к низким температурам зимы наибольшее участие принимают белковые вещества. Их количество значительно увеличивается при переходе от периода активного роста побегов к периоду глубокого покоя у всех изученных видов рода Picea . Накопление белков вызывает снижение уровня суммарных свободных аминокислот большинства видов интродуцентов, в то время как у местного вида содержание аминокислот сохраняется на достаточно высоком уровне. Исключением из интродуцентов является P. mariana , в хвое которой уровень свободных аминокислот повышается к периоду глубокого покоя почти в той же степени, что и белков. В хвое большинства изученных видов рода Picea к периоду глубокого покоя уменьшается доля глутаминовой кислоты и алана-нина и увеличивается доля аргинина и этанолами-на в общей сумме аминокислот. Увеличение содержания суммарных липидов и фосфолипидов в хвое при переходе к периоду глубокого покоя менее существенное, чем белков. В хвое аборигенного вида в сравнении с хвоей интродуцентов, суммарные липиды активнее используются в фазу интенсивного роста побегов.

Несмотря на некоторые различия, интродуцированные виды рода Picea приспосабливаются к перенесению низких температур с помощью тех же биохимических механизмов, что и местный вид. Это свидетельствует об успешной адаптации изученных интродуцированных видов к новым условиям существования.

Исследование выполнено при поддержке РФФИ (проект 18-44-100002 р_а).