Динамика содержания карбоновых кислот в проростках огурца при гипертермии в зависимости от теплового и холодового закаливания

В настоящее время довольно хорошо изучена физиология и биохимия теплового шока, который рассматривается как неспецифический стрессор, способный модифицировать метаболизм любого живого организма. Показано, что последствия будут зависеть от режима гипертермии, генетических особенностей организма, стадии онтогенеза, а также от теплового или холодового закаливания [Таланова и др., 1993; Кузнецов, Дмитриева, 2006; Чудинова, Суворов, 2011]. Последнее рассматривается как неспецифическое воздействие, запускающее адаптивные процессы [Ба-лагурова, Акимова, Титов, 2001; Трунова, 2007; Титов, Таланова, 2009; Чудинова, Суворов, 2011]. Однако молекулярно-биохимические механизмы закаливания остаются до конца не выясненными. Недостаточно исследованы системы устойчивости растений к одновременному действию пониженной и высокой температуры. Анализ литературы демонстрирует их многообразие и вовлечение в них низкомолекулярных метаболитов, в том числе пролина, полиаминов, веществ фенольной природы, а также каротиноидов. Вклад каждого из этих соединений в защитный ответ организма неравнозначен и, возможно, приурочен к различным стадиям адаптационного процесса или является видоспецифичным [Чиркова, 2002; Титов, Таланова, 2009].

В литературе имеются указания на участие органических кислот в механизмах адаптации. Так, некоторые авторы отметили изменение содержания некоторых органических кислот у галофитов и ряда гликофитов при засолении [Матухин, 1963]. Изучение обмена органических кислот у растений в условиях стресса представляет интерес с точки зрения связующего звена между углеводным и азотным обменом. Однако оценка значимости процессов обмена органических кислот для формирования устойчивости к температурным воздействиям фактически не проводилась.

В связи с вышеизложенным, целью нашей работы было изучение влияния теплового и холодового закаливания на содержание некоторых карбоновых кислот в проростках теплолюбивых растений (огурец) в процессе их адаптации к последующей гипертермии.

Объекты и методы исследования

Проростки огурца посевного ( Cucumis sativus L.) сорта «Родничок» в течение 15 сут. выращивали в климатической камере ШН-М на вермикулите при температуре 22 ° С, влажности 80-85% и освещенности люминесцентными лампами 18 ч. в сутки (1 вариант – контроль). Затем часть проростков (опытные варианты) подвергали температурному воздействию по следующей схеме: 2-й вариант - гипертермия (40 ° С, 7 сут.); 3-й вариант - тепловое закаливание (30 ° С, 1 сут.), затем гипертермия (40 ° С, 6 сут.); 4-й вариант - холодовое закаливание (10 ° С, 1 сут.), затем гипертермия (40 ° С, 6 сут.).

Режимы тепловой и холодовой обработки были выбраны на основании данных литературы [Чуди-

нова, Суворов, Механошина, 2001; Титов, Таланова, 2009; Чудинова, Суворов, 2011].

Для анализа брали растения через 12 ч. (стадия стресс-реакции адаптации) и 72 ч (стадия адаптации) после окончания всех обработок.

Анализировали прирост проростков за 3 сут. В побегах, фиксированных паром (5 мин.) и досушенных до воздушно-сухого состояния, определяли содержание щавелевой, лимонной, фумаровой кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Ultimate 3000 (Dionex, Германия) при 210 нм. Тип хроматографической колонки – Acclaim® C18; 3 мкм; 120 Ǻ 2.1×210 мм. В качестве подвижной фазы использовались элюэнты: ацетонитрил (ОСЧ для ВЭЖХ и фосфатный буфер (25 мМ КН2РО4 с рН 3.6). Градуировка прибора проводилась по государственным стандартным образцам (ГСО) карбоновых кислот с чистотой не менее 98% [Руководство по методам…., 2004]. Повторность биохимических анализов – 3-кратная.

Результаты обрабатывали статистически с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Рассчитывали среднюю арифметическую величину, ошибку средней арифметической, достоверность различий между вариантами по критерию Стьюдента (р ≤ 0.05).

Результаты и их обсуждение

Важным показателем устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов является изменение их роста.

Нами была проанализирована величина прироста проростков за 7 сут. эксперимента (рис. 1). Показано, что прирост в условиях гипертермии (40 ° С, 7 сут.) существенно уменьшался. Предварительное тепловое закаливание снизило рост ингибирующий эффект гипертермии. Холодовое закаливание не оказало заметного влияния на последующий рост проростков в условиях гипертермии. Таким образом, наши результаты свидетельствуют об ограниченных адаптивных возможностях теплолюбивых проростков огурца при холодовом закаливании.

Известно, что при закаливании реализуются разные физиологические программы [Титов, Таланова, 2009]. При физиологически нормальных температурах осуществляется ростовая и онтогенетическая программа. Низкие и высокие закаливающие температуры вызывают своеобразное «генетическое перепрограммирование», при этом реализация ростовой и онтогенетической программ тормозится или полностью блокируется, а жизнеспособность растения в этих условиях, прежде всего, связана с запуском адаптивной программы, направленной на повышение их устойчивости. Повреждающие высокие температуры приводят к структурным и функциональным повреждениям, в результате которых происходит гибель клеток.

Возможно, что закаливание, как краткосрочное повреждающее воздействие, вызывает появление в клетках соединений, которые являются результатом определенных (обратимых) нарушений и одновременно выполняют функции сигнала, запускающего механизмы формирования повышенной резистентности. В отсутствие такого сигнала (при действии более низких температур) адаптивный потенциал растений, очевидно, проявляется не в полной степени.

Рис. 1 . Динамика прироста проростков огурца в контрольном и опытных вариантах за 7 сут.: 1 - вариант - контроль (23 ° С, 7 сут.); 2 - вариант - гипертермия (40 ° С, 7 сут.); 3 - вариант - тепловое закаливание (последовательно 30 ° С, 1 сут. и 40 ° С, 6 сут.); 4 – вариант – холодовое закаливание

(последовательно 10 ° С, 1 сут. и 40 ° С, 6 сут.); * различия между вариантами достоверны по критерию Стьюдента (р ≤ 0,05)

В литературе высказывается мнение, что синтез и компартментализация органических кислот в клетке четко регулируются, однако точная оценка величины и состава пулов этих соединений у растений практически отсутствует [Осмоловская, Попова, Кучаева, 2003].

Полагают, что в цитозоле этот пул метаболически активен, относительно стабилен и вследствие нейтральных значений рН представлен не свободными кислотами, а преимущественно их диссоциированными анионами или водорастворимыми калиевыми солями. Вакуолярный пул является временным, динамичным, быстро утилизируемым в темноте для метаболизма в цитозоле и представляет комплексы с катионами кальция и магния [Осмоловская, 2007].

Отсутствие данных по влиянию гипертермии на обмен органических кислот побудило нас провести исследования такого плана.

Из большого разнообразия органических кислот для анализа мы выбрали следующие карбоновые кислоты: щавелевую, лимонную и фумаровую.

В литературе имеются сведения о том, что щавелевая кислота вовлечена в поддержание катионанионного баланса и рН-гомеостаза растений [Осмоловская, 2007]. Известно также, что из-за уве- личения проницаемости мембран при гипертермии катион-анионный гомеостаз нарушается. У растений за эту регуляцию отвечают два механизма: биофизический – электрогенная АТФ-зависимая протонная помпа, с помощью которой ионы водорода выводятся через мембраны наружу против электрохимического градиента, и биохимический – рН-чувствительные процессы карбоксилирования и декарбоксилирования органических кислот, в ходе которых продуцируется или потребляется протон.

Установлена способность многих растений накапливать значительные количества оксалата. Од- нако исследования, направленные на оценку степени его вовлечения в формирование ионного гомеостаза растений, крайне малочисленны, и процессы синтеза щавелевой кислоты в них, как пра- вило, трактуются как вторичные по отношению к минеральному обмену растительного организма [Осмоловская и др., 2002].

Полученные нами результаты показали у кон- трольных растений достаточно высокий уровень свободного оксалата по сравнению с содержанием цитрата или фумарата (рис. 2).

Рис. 2 . Динамика содержания щавелевой кислоты у проростков огурца при действии закаливающих и повреждающих температур

Гипертермия без закаливания вызвала сильное увеличение количества оксалата (в 1.7 раза по сравнению с контролем), которое оставалось стабильно высоким на протяжении всего эксперимента (7 сут.).

Динамика оксалата в вариантах с холодовым и тепловым закаливанием у проростков огурца была разной. Так, тепловое закаливание вызвало резкий подъем количества этой кислоты, а холодовое – понижение по сравнению с контролем.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о вовлечении оксалата в формирование ионного гомеостаза растений в процессе адаптации к гипертермии. Некоторые авторы также приходят к выводу, что контролируемая аккумуляция калиевых солей щавелевой кислоты является доминирующим фактором, определяющим формирование катион-анионного баланса и задающим осмотический потенциал клеток листа [Ruiz, Mansfield, 1994; Franceschi, 2001; Осмоловская, 2007].

Результаты определения цитрата показали, что в норме его уровень в проростках огурца был стабильно высоким в течение 7 сут. эксперимента (рис. 3).

Гипертермия без закаливания, а также гипертермия после теплового закаливания вызвали небольшое увеличение уровня цитрата по сравнению с контролем. При гипертермии после холодового закаливания количество цитрата вначале достоверно снизилось по отношению к контролю, а затем имело тенденцию к возрастанию до уровня контроля.

Рис. 3 . Динамика содержания лимонной кислоты у проростков огурца при действии закаливающих и повреждающих температур

Содержание фумарата в норме у исследуемых растений было значительно ниже, чем оксалата и цитрата, что соответствует данным литературы [Землянухин, Землянухин, 1995] (рис. 4).

Рис. 4 . Динамика содержания фумаровой кислоты у проростков огурца при действии

закаливающих и повреждающих температур

Во всех опытных вариантах количество фумарата имело явную тенденцию к снижению по сравнению с контролем, особенно при действии гипертермии после холодового закаливания.

Различия в содержании в растениях отдельных карбоновых кислот следует рассматривать как следствие различий скоростей ферментативных реакций, лежащих в основе их образования и превращения. В этом смысле первостепенную роль играют ферментативные реакции ЦТК (цикл трикарбоновых кислот).

Накопление цитрата и фумарата свидетельствует о превращениях, идущих по ЦТК, причем ги- пертермия оказывает непосредственное влияние на ход таких превращений. Известно, что лимитирующей реакцией всего ЦТК является реакция синтеза цитрата (фермент цитратсинтетаза). В наших исследованиях содержание цитрата при гипертермии значительно повышалось, а фумарата – было на уровне контроля. Последнее может является показателем стабильной скорости ЦТК, которая в норме должна соответствовать скорости гликолиза.

На основании этого можно предположить, что при гипертермии усиливается другая важная функция ЦТК – анаболическая, т. е. промежуточные соединения ЦТК включаются в процессы биосинтеза и, в первую очередь, аминокислот. Последнее, с одной стороны, обеспечивает усиленный белковый синтез (БТШ), а с другой – нейтрализует избыток аммиака.

Имеются данные о том, что некоторые ферменты ЦТК (в том числе цитратсинтетаза) имеют разную компартментализацию в растительной клетке и являются множествеиными молекулярными формами (изоферментами, т.е. кодируются различными генами). Установлено также, что долговременное влияние теплового закаливания может сопровождаться изменениями изоферментных спектров [Martins et al., 1999]. Ферменты трикарбоновых кислот, участвующие в анаболических реакциях, пространственно разобщены от ферментов ЦТК, находятся в цитоплазме и участвуют в синтезе аминокислот. Ферменты же ЦТК, выполняющие энергетические функции, локализованы в митохондриях. Именно участие изоферментов в различных процессах и обусловливает разницу их свойств [Землянухин, Землянухин, 1995].

Оксикислоты могут образовываться не только в ЦТК, но и в результате протеолиза и дезаминирования аминокислот. Например, глутамат может последовательно превращаться в α-кетоглутарат, изоцитрат, цитрат и малат. Повышение содержания большинства кетокислот может вызываться также как снижением активности процессов их прямого аминирования, так и задержкой гликолитического распада сахаров.

На основании полученных нами результатов можно заключить, что тепловое закаливание, как правило, вызывает аккумуляцию щавелевой, лимонной и фумаровой кислот, тогда как холодовое закаливание приводит к падению их уровня. Это подтверждает участие органических кислот в механизме теплового и холодового закаливания растений к действию последующей гипертермии. Вклад каждой из изученных нами органических кислот в процесс закаливания и защитный ответ на действие повреждающей температуры неравнозначен и, возможно, приурочен к различным стадиям адаптационного процесса или является видоспецифичным.