Динамика углевод - ферментного комплекса проростков ржи при адаптации к ионам свинца после теплового закаливания и без него

Тяжелые металлы (в первую очередь ртуть, кадмий и свинец) относятся к числу наиболее опасных химических загрязняющих веществ, которые даже в небольших количествах способны оказывать токсическое влияние на различные организмы, в том числе на растения. В силу этого ведутся активные исследования металлоустойчивости растений, однако полученные сведения зачастую носят противоречивый характер. Кроме того, такие работы в основном касаются дикорастущих видов растений, тогда как культурные виды изучены в гораздо меньшей степени [Yang et al., 2005; Титов, Казнина, Таланова, 2014].

Недостаточно сведений и о закаливающем дей- ствии повышенной температуры на развитие ме-таллоустойчивости растений, хотя во многих исследованиях отмечается протекторный эффект кратковременного теплового шока к последующему тепловому, холодовому, солевому воздействию и водному дефициту [Титов, Таланова, 2009].

Важная роль углеводного обмена для процессов адаптации растений к различным стрессорам в настоящее время не вызывает сомнения. Однако направленность превращений углеводноферментного комплекса в условиях стресса до настоящего времени остается предметом дискуссии. Одни авторы считают, что это результат деструктивных процессов, связанных с повреждением клеток, другие – одна из составляющих ком-

плекса защитных реакций на стресс [Сабельникова, 2007; Трунова, 2007]. Следует отметить, что наибольшее количество экспериментальных данных по углеводному обмену получено при изучении гипотермии. В то же время исследованию роли данного обмена в формировании металлоустой-чивости уделялось значительно меньше внимания.

Сформировалось мнение, что усиление гидролиза полимерных форм углеводов, в том числе и низкомолекулярных олигосахаридов, является неспецифической ответной реакцией растений на неблагоприятные воздействия различной природы [Карпец, Колупаев, 2009]. Но четкие экспериментальные доказательства связи активности гидролитических ферментов с формированием металло-устойчивости растений на сегодняшний день отсутствуют.

Следует также отметить, что в большинстве работ изучалась динамика концентрации углеводов в растительных клетках в состоянии стресса, но не учитывалась их компартментация (или разделение на отдельные фонды). Необходимость компарт-ментирования низкомолекулярных сахаров определяется их полифункциональностью на уровне клетки. Проявляется компарментация в том, что в определенных физиологических или биохимических процессах участвует не вся масса внутриклеточного вещества, а только некоторая его часть. Иными словами – в разной доступности разных фондов для определенных функций, что обеспечивается наличием внутриклеточных мембран. Не исключена, хотя и имеет меньшее значение, ком-партментация, основанная на различии свойств отдельных зон цитозоля в пределах клетки [Холодова, 1978]. Проведенные нами ранее исследования позволили сделать предположение, что изменение компартментации глюкозы и сахарозы, является условием реализации защитных функций этих моносахаридов в условиях стресса [Чудинова, Чернышева, 2017].

Все вышесказанное даёт основание для изучения динамики свинцовой устойчивости проростков ржи, содержания в них свободного (СФ) и ком-партментированного (КФ) фондов глюкозы и активности ключевых гидролитических ферментов углеводного обмена (амилазы и инвертазы) в условиях наличия или отсутствия предобработки повышенной температурой, что и является целью данной работы.

Объект и методы исследований

Исследования проводили на 10-дневных проростках ржи посевной (озимая форма, сорт Вятка 2), которые выращивали на вермикулите в климатической камере ШН-М при температуре 20°C, влажности 75% и освещенности люминесцентными лампами 16 ч. в сутки (1-й вариант – контроль).

Затем проростки подвергали стрессовым воздействиям по следующей схеме: 2 вариант – экспозиция на 1 мМ растворе ацетата свинца; 3 вариант – предобработка 3 ч. при +40°C, затем экспозиция на 1 мМ растворе ацетата свинца.

Анализировали интенсивность роста по длине побега и его сырой массе на 3-и и 8-е сут. свинцового стресса (повторность 20-кратная); содержание СФ глюкозы (экстракция из гомогената 10 мин. при 80°С) и КФ глюкозы (экстракция из гомогената 50 мин. при 80°С) определяли по методу Вознесенского [Большой практикум …, 2012] (повторность 3-кратная); интенсивность фотосинтеза определяли фотоколориметрическим методом по содержанию углерода в листьях [Аликов, 1983] (повторность 3-кратная).

Результаты обрабатывали статистически, с использованием однофакторного дисперсионного анализа в программе Stadia. Определяли достоверность различий между вариантами по наименьшей существенной разнице (d > НСР 0.05 ).

Результаты и их обсуждение

Рост является интегральным показателем, отражающим степень адаптации растения к окружающей среде, а торможение ростовых процессов – это один из ранних признаков повреждающего действия неблагоприятных факторов на растения. Нами были проанализированы два параметра, характеризующих интенсивность роста: линейные размеры и сырая масса побегов ржи (рис. 1).

Полученные результаты показали заметное ингибирование накопления сырой биомассы побегов ржи после 3-суточного роста на 1мМ растворе ацетата свинца и последующую остановку роста проростков на 8-е сут. в этих же условиях по сравнению с контролем. Предварительное тепловое воздействие (+40оС, 3 ч.) заметно уменьшило рост ингибирующий эффект свинца (рис.1, А). Сходные тенденции (но с меньшей амплитудой) наблюдали и в отношении динамики длины побегов (рис. 1, Б).

Токсическое действие тяжелых металлов на растения основано на следующих процессах: вмешательство в функционирование ферментных систем; нарушение баланса элементов питания; изменение мембран, приводящее к нарушению ближнего и дальнего транспорта [Титов, Казнина, Таланова, 2014].

Полученные нами данные вполне согласуются с имеющимися в литературе сведениями о повышении металлоустойчивости растений после непродолжительной тепловой предобработки [Титов, Таланова, 2009; Чудинова, Чернышева, 2017]. Можно предположить, что это является результатом теплового закаливания, которое, как правило, сопровождается изменениями термостабильности белков и определенных функций клеток, в резуль- тате чего активируются защитно-приспособительные процессы. Многие авторы положительное влияние теплового закаливания на последующую устойчивость растений к разным стрессорам связывают с индукцией синтеза белков теплового шо- ка и с их активным участием в защите клетки от токсичного действия тяжелых металлов [Suzuki, Koizumi, Sano, 2001; Карпец, Колупаев, 2009; Титов, Казнина, Таланова, 2014].

Рис. 1 . Динамика биомассы (А) и длины побегов (Б) проростков ржи при свинцовом стрессе в условиях предобработки повышенной температурой и без нее

Здесь и далее: 1 – контроль; 2 – экспозиция на1 мМ растворе ацетата свинца; 3 – экспозиция 3 ч. при 40°C, затем на 1 мМ растворе ацетата свинца. * - различие с 1-м вариантом достоверно; # ^- различие со 2-м вариантом достоверно (d > НСР 0.05 )

Не вызывает сомнения, что адаптация растений к действию тяжелых металлов представляет собой сложный многокомпонентный процесс, включающий различные физиолого-биохимические механизмы, которые, дополняя друг друга, обеспечивают определенный уровень металлоустойчивости, зависящий от генотипа [Титов, Таланова, 2009].

Полученные нами ранее результаты показали участие обоих фондов (СФ и КФ) глюкозы и саха- розы в формировании устойчивости овса к кадмиевому стрессу [Чудинова, Чернышева, 2017]. Было сделано предположение, что СФ растворимых сахаров участвует в активном метаболизме, а КФ – в формировании кадмиевой устойчивости.

Как видно из рис. 2, у контрольных проростков ржи количество обоих фондов глюкозы было примерно одинаковым и достаточно стабильным в течение всего эксперимента.

Рис. 2. Динамика содержания СФ (А) и КФ (Б) глюкозы в проростках ржи при свинцовом стрессе в условиях предобработки повышенной температурой и без нее

В условиях монодействия свинца (рис. 2, 2-й вар.) наблюдалось существенное уменьшение уровня глюкозы на 3-и сут. воздействия до 37% (СФ) и 27% (КФ) от контроля. По мере увеличения времени экспозиции до 8 сут. содержание обоих фондов глюкозы падало до 13‒16% от контроля.

При комбинировании теплового закаливания и последующей экспозиции в растворе свинца (рис. 2, 3-й вар.) содержание обоих фондов глюкозы также падало, однако амплитуда снижения была значительно меньше (до 63% от контроля при 3-суточной экспозиции и до 23% от контроля при 8- суточной экспозиции), чем в варианте с монодей- ляются составной частью механизма теплового за- ствием свинца.

На основании полученных результатов можно предположить, что рост, ингибирующий эффект свинца, связан с существенным снижением уровня СФ и КФ глюкозы, особенно в период специализированной адаптации (8-суточный стресс). Возможно, это определяется интенсивным расходом глю- козы на поддержание структурного и энергетического метаболизма в условиях свинцового стресса. Так, уменьшение содержания растворимых сахаров некоторые авторы объясняют расходованием глюкозы на перехват активных форм кислорода и на включение альтернативных путей дыхания [Дерябин и др., 2007].

Поскольку тепловая предобработка примерно в каливания, направленного на развитие адаптационных процессов, обеспечивающих повышение металлоустойчивости растений. В большей степени положительный эффект закаливания проявился при 3-суточном свинцовом стрессе, тогда как при более длительном воздействии свинца (8 сут.) – был существенно слабее.

Внутриклеточная концентрация растворимых сахаров у растений определяется главным образом интенсивностью фотосинтеза, гидролизом запасных полисахаридов, а также скоростью их оттока из листьев в нефотосинтезирующие органы.

В связи с этим одной из наших задач было изучение интенсивности фотосинтеза проростков. Полученные результаты (рис. 3) показали существен- одинаковой степени влияла на СФ и КФ глюкозы, а именно обеспечивала более высокий их уровень ное снижение этого показателя в условиях свинцо- вого стресса (особенно на 8-е сут. воздействия), в условиях последующего свинцового стресса, то  которое, однако, было достоверно меньше в вари- можно предположить, что оба фонда глюкозы яв-   анте с предварительным тепловым закаливанием.

Рис. 3 . Динамика интенсивности фотосинтеза в проростках ржи при свинцовом стрессе в условиях предобработки повышенной температурой и без обработки

Негативное действие тяжелых металлов на фотосинтез проявляется в нарушении ультраструктуры хлоропластов, уменьшении содержания фотосинтетических пигментов, ингибировании активности ферментов цикла Кальвина, а также в замедлении скорости электронного транспорта и поступления в клетки СО 2 . Причем степень торможения фотосинтеза во многом зависит от концентрации металла в окружающей среде [Титов, Каз-нина, Таланова, 2014].

Содержание растворимых сахаров в условиях воздействия стрессоров различной природы, по мнению некоторых авторов [Трунова, 2007], в значительной степени определяется активностью гидролитических ферментов – амилазы и инвертазы. Амилолитическая активность определяет уровень пластидного крахмала, а также крахмала амилопластов, выполняющих роль своеобразного депо глюкозы. Инвертаза катализирует необратимое расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу, которые затем используются в процессе метаболизма.

В растениях было зафиксировано как увеличение, так и падение активности гидролитических ферментов в ответ на стрессы различной природы, интенсивности и продолжительности (гипертермию, засоление, обезвоживание, раневые воздействия, заражение патогеном). При этом, как отмечают авторы [Сабельникова, 2007; Синкевич и др., 2008], изменение активности амилазы и инвертазы может происходить быстро за счет регуляции каталитической активности уже существующих молекул фермента в результате взаимодействия с гетерогенными белками-ингибиторами, изменения изоферментного состава, а также вследствие взаимного перехода растворимой и связанной форм. Нами была исследована динамика активности амилазы и инвертазы в проростках ржи при монодействии ацетата свинца в условиях от- (рис. 4). сутствия или наличия тепловой предобработки

Рис. 4 . Динамика активности амилазы (А) и инвертазы (Б) в побегах ржи при свинцовом стрессе в условиях предобработки повышенной температурой и без нее

Полученные результаты показали рост активности амилазы в условиях свинцового стресса, усиливающийся по мере длительности воздействия (рис. 4, А). При комбинировании теплового закаливания и ацетата свинца повышенный уровень активности амилазы сохранился, но был достоверно ниже, чем в варианте с монодействием свинца.

Поскольку наблюдаемое нами увеличение активности амилазы при свинцовом стрессе не приводило к росту содержания глюкозы, то можно предположить изменение в этих условиях соотношения между изоформами амилазы в сторону увеличения доли β-амилаз, которые относят к стресс-индуцируемым белкам. Результатом гидролиза крахмала под действием β-амилаз является накопление мальтозы, а не глюкозы [Даффус, Даффус, 1987].

Было установлено снижение активности инвертазы в побегах опытных вариантов, причем более сильное в условиях монодействия свинца по сравнению с контролем, и менее сильное в варианте с тепловым закаливанием (рис. 4, Б). Можно предположить, что пониженная активность инвертазы, которая сопровождалась снижением уровня глюкозы, указывает на возможную загрузку флоэмы и транспорт сахарозы в корни в условиях свинцового стресса, что, вероятно, имеет адаптивное значение. В литературе уже указывалось, что процессы оттока сахаров из листьев в корни играют значительную роль в адаптации теплолюбивых растений к низким положительным температурам [Попов, 2002].

Резюмируя полученные нами данные, следует отметить, что у проростков ржи примерно в одинаковом соотношении формируются два фонда глюкозы – свободный, предположительно участвующий в активном метаболизме, и компартментиро-ванный, предположительно участвующий в формировании устойчивости. Адаптация проростков к свинцовому стрессу сопровождается значительным снижением уровня обоих фондов глюкозы. Основной причиной этого следует рассматривать показанное нами отрицательное воздействие свинца на интенсивность фотосинтеза. Другой возможной причиной можно считать высокую степень метабо-лизации глюкозы, ее непосредственное участие в формировании устойчивости. Об этом косвенно свидетельствует повышенная активность амилазы у проростков, подвергнутых воздействию свинца. Снижение активности инвертазы в этой ситуации, вероятно, должно усиливать отток сахаров из листьев в корни, что также является адаптивной реакцией.

Предварительное тепловое закаливание ослабляет негативный эффект свинца на все изучаемые нами показатели обмена глюкозы. Можно предположить, что в реализации механизма теплового закаливания участвуют оба фонда глюкозы (СФ и КФ), что обеспечивает сочетание повышенного уровня жизнедеятельности и развитие высокой ме-таллоустойчивости растений.