Динамика витаминов и фенолов субкренаты Альхемилла по суточному изменению температуры в октябре

С каждым годом все сильнее возрастает исследовательский интерес к лекарственным растениям. В связи с этим открывается все больше новых биологически активных веществ (БАВ) в уже известных лекарственных растениях и расширяется список растений, которые могут служить ценным источником лекарственных соединений (Dvornikova, Turetskova, 2013).

В то же время, содержание БАВ в тканях растений существенно отличается не только от вида, популяции, сорта, расы и морфы (Pravdivtseva and Kurkin, 2009; Karpova et al ., 2009; Karpova and Karaulov, 2013), от ткани и органа растений (Gubin and Hapina, 2013; Hramova et al ., 2013; Petruk, 2013), но и от климатических условий произрастания (Shaldaeva, 2009), типа почвы, фитоценотического окружения (Plaksina et al ., 2009), близости источников техногенного загрязнения (Pell, 1984; Kurkina, 2013; Skochilova and Zakamskaja, 2013), фазы развития и региона произрастания (Shaldaeva, 2009). Весомый вклад в изучение растительных тканей как потенциальных источников ценных биологически активных компонентов внесло появление таких методов как ВЭЖХ и УФ-спектроскопия, позволивших быстро и точно проводить подробный анализ экстрактов на широкий спектр соединений (Poluektova et al ., 2011).

Наиболее важными компонентами листьев растений являются белки, углеводы, жирные кислоты, витамины и широкий спектр фенольных соединений, включающий танины, дубильные вещества, флавоноиды. Главный лечебный эффект растений связывают именно с флавоноидами, обладающими не только относительно высокими концентрациями в тканях растений, но и широким спектром действия на человеческий организм. С летучими флавоноидами связывают бактерицидный эффект лекарственных растений на человека (Hramova et al., 2013) и устойчивость самих растений к грибковым и бактериальным заболеваниям (German et al., 2013). Как фенольные соединения, они могут активно принимать участие в окислительновосстановительных реакциях клеток растений и участвовать в реакциях растений на стресс (Lavid et al., 2001; Artemkina and Gorbacheva, 2009; Dai and Mumper, 2010). Накопление флавоноидов в растениях находится в сильной зависимости от экологических факторов (Alekseeva et al., 2010; Karpova and Karaulov, 2013), что связано с важностью выполняемых ими функций (Kuvacheva et al., 2011; Hramova et al., 2013; Karpova and Karaulov, 2013). В этой связи возрастает роль фенольных соединений не только как важного компонента лекарственного сырья, но и как показателя устойчивости растений (Pell, 1984).

Изучение динамики аскорбиновой кислоты как компонента антиоксидантной системы в листьях лекарственных растений тоже позволяет оценивать влияние на растительный организм стрессовых факторов окружающей среды, включая сезонные и суточные перепады температур (Skochilova and Zakamskaja, 2013; Chanishvili et al .,

В Иркутской области и Республике Бурятия активно изучаются флавоноиды и другие БАВ рододендрона (Karpova and Karaulov, 2013; Mirovich et al ., 2005), шлемника байкальского (Chirikova et al ., 2009), ортилии однобокой (Lomboeva et al ., 2008) и некоторых других лекарственных растений (Lusandorzhieva, 2009). Биологически активные вещества манжетки в условиях Прибайкалья до сих пор не исследованы.

В целом, химический состав манжеток изучен недостаточно. Известно, что в надземной части находятся дубильные вещества (7.2–11.3 %), катехины. В зелёной части растения дубильных веществ от 7.5 до 9.4 %, здесь же присутствуют флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и их производные (лутеоновая, эллаговая), лигнин, липиды, кумарины. В листьях дубильных веществ значительно меньше – до 2.5 %, зато витамина С до 210 мг %. В различных частях растения содержатся также железо, бор, марганец, медь, цинк, молибден, никель (Vinogradov et al ., 1991; Lesovaja et al ., 2010).

Необходимость изучения манжетки в Прибайкалье становится актуальной, если брать во внимание значительные различия в содержании флавоноидов, витаминов и других БАВ в зависимости от района произрастания. Учитывая то, что растения в условиях Сибири находятся под влиянием сильных перепадов температур даже в течение суток, на наш взгляд важно изучать содержание фенольных соединений и витаминов в листьях лекарственных растений не только в разные сезоны года, но и в течение суток. Суточная и сезонная динамика лекарственных компонентов важна для научного обоснования оптимальных сроков и времени сбора растительного сырья применительно к конкретному региону.

Витамин РР активно выступает в роли кофермента в окислительно-восстановительных процессах и в обмене белков, липидов и углеводов. Витамин В 6 , или пиридоксин, является важным коферментом в реакциях синтеза и расщепления аминокислот. Учитывая их ключевую роль в белковом обмене, целесообразно было дополнительно вместе с ними исследовать группу белков, синтезируемых как при тепловом, так и при холодовом стрессе. Осенние перепады температур в Сибири при положительных температурах днем и отрицательных ночью создают идеальные условия для всестороннего проявления адаптации растений, в отличие от лета и зимы, где превалирует только холодовой или только тепловой стресс. Для весны, когда наступает активная фаза вегетации и происходит активное наращивание растительной биомассы, стрессовое влияние может быть замаскировано общей активацией физиологических процессов в клетках растений.

В этой связи целью работы было изучение содержания фенольных соединений, витаминов С, В 3 и В 6 и стрессовых белков в листьях манжетки городковатой в зависимости от времени суток на побережье озера Байкал в октябре месяце.

MATERIALS AND METHODS

Объектом исследования служили листья манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser, произрастающей на левом берегу реки Выдриная в 700 м от уреза озера Байкал, стационар Сибирского института физиологии и биохимии растений (СИФИБР) СО РАН «Речка Выдриная», юго-восточное побережье Байкала, разнотравный луг. Пробы отбирались в течение суток с интервалом в 3-6 часов: в 600, 900, 1500, 2000 и 2400 часа во вторую декаду октября. Выбор времени суток для отбора был привязан к наиболее заметным изменениям в суточном ходе температур атмосферного воздуха. В листьях определялось содержание ФС и витаминов C, РР и В6. Сухой вес определялся стандартным методом высушивания при температуре 105 °С до постоянного веса.

Определение содержания фенольных соединений (ФС) осуществляли после тройного экстрагирования кипящим 80% метанолом и очисткой объединенного экстракта хлороформом от липофильных пигментов с последующей экстракцией фенольного комплекса этилацетатом. Общее содержание ФС определяли с помощью реактива Фолина-Дениса при 720 нм с помощью SPECORD S 100 («Analytikjena», Германия). Для построения калибровочной кривой использовали коммерческий препарат кверцитина («Sigma», США).

Определение содержания витаминов в листьях растений осуществляли следующим образом. Измельченное растительное сырье (2 г) с 2 мл 40 мМ раствора аммиака подвергали обработке ультразвуком при 30–40 °С в течение 15 мин. Полученную смесь центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, супернатант фильтровали (фильтр 0.45 мкм). В 0.5–1 мл фильтрата определяли содержание водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза в системе G1600AX CE 3D (Agilent Technologies, Германия). Условия анализа: кварцевый капилляр, полная длина 48 см, рабочая длина 40 см, внутренний диаметр 50 мкм. Для разделения использовали 20 мМ тетраборатный буфер с рН 9.3. Ввод пробы осуществляли гидродинамическим способом (50 мбар · 4 сек), рабочее напряжение 20 кВ, температура в кассете с капилляром 30 °С. Детектирование осуществляли с помощью диодной матрицы, на длинах волн 200, 254, 280, 599 нм.

Выделение белка осуществляли по общепринятой методике с выравнием белка по методу Лоури и последующим электрофорезом в ПААГ в модифицированной системе Лэммли на приборе Mini-PROTEAN III Cell (BIO-RAD, США) (Pobezhimova et al ., 2004). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (“AMERSHAM”, США) и последующую обработку антителами проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Концентрацию белка определяли по интенсивности окраски мембраны в программе GEL Analysis (1.0).

Все образцы исследовались в трех биологических повторностях. На графиках приведены средние значения и стандартные отклонения содержания фенольных соединений и витаминов. Рассчитывали линейные коэффициенты корреляции и уровень значимости по Спирману в программе StatSoft (Statistica 6.0).

RESULTS AND DISCUSSION

Суточная динамика температуры в дни исследования. Суточный ход температур осенью, зафиксированный на участке отбора проб во время исследований показал значительную амплитуду температур даже в пределах одних суток с минимумом в 6-9 часов и максимумом значений в 15–17 часов, что характерно для территории Сибири. Разница температур в течение суток достигает 14 °С и выше. Учитывая динамику температурного режима, образцы листьев манжетки городковатой отбирались в 6, 9, 15, 20 и 24 часа (табл. 1).

Суточные изменения содержания фенольных соединений. Общее содержание ФС существенно изменялось в течение суток (табл. 1) и максимальное содержание в пересчете на сухой вес приходилось на шесть часов утра (28.8 мг/г сухого веса). В освещенное время суток содержание ФС значительно ниже и минимально в послеполуденное время (4.7 мг/г в 15 ч). К 20–24 часам вечера содержание ФС постепенно возрастает до 10.2–11.0 мг/г. Такая суточная динамика вероятно объясняется тем, что ФС на свету активно окисляются, а также возможным накоплением ФС в холодное время суток как адаптивную реакцию на гипотермию и усиливающийся окислительный стресс. Подтверждает нашу гипотезу суточная динамика содержания аскорбиновой кислоты (АСК) (табл. 1), являющейся важным индикатором окислительных процессов в клетках и тканях растений (Maevskaja and Nikolaeva, 2013; Skochilova and Zakamskaja,

Содержание аскорбиновой кислоты (витамина С). Максимум содержания АСК приходится тоже на 6 часов утра (648.2 мкг/г сухого веса), а минимум на 15 часов (5.0 мкг/г). К 20 и 24 часам содержание АСК снова возрастает (до 17.6 и 48.6 мкг/г соответственно). Обращает на себя внимание тот факт, что суточная динамика АСК повторяет динамику ФС.

Динамика некоторых витаминов группы В. Была изучена суточная динамика витаминов РР и В 6 (табл. 1). Витамин РР, или В 3 , активно выступающий в роли кофермента в окислительновосстановительных процессах и в белково-липидно-углеводном обмене через обмен пировиноградной кислоты, показал максимум содержания в 9–15 часов дня (96.1–174.5 мкг/г), что может быть связано с активизацией биосинтетических процессов на фоне активного фотосинтеза. Витамин В 6 , или пиридоксин, показал в 9 и 15 часов содержание 216.2–217.9 мкг/г сухого веса. В то же время, его содержание в относительно холодное время суток повышалось еще сильнее (259.0–328.7 мкг/г). Возможно, это было связано с усиленным синтезом белков теплового и холодового шока, возможно – с накоплением аминокислот, выполняющих криопротекторную функцию.

Суточные изменения в количестве БТШ в зависимости от содержания витаминов. Для проверки гипотезы нами был проведен иммуноблотинг проб листьев манжетки на следующие стрессовые белки: белки теплового шока БТШ 70, 60, 101 и 17.6, а также на экспрессирующийся при холодовом воздействии (cold regulated protein) COR14b (табл. 2).

Конститутивные БТШ 70 и 60 присутствовали во всех образцах листьев манжетки. БТШ 101, который синтезируется в ответ на тепловой стресс, не был обнаружен. Эти результаты согласуются с ранее изученной сезонной динамикой БТШ манжетки городковатой, у которой БТШ 101 детектировался в августе, когда относительно жарко и сухо, а в октябре его не наблюдалось (Zhivetev et al., 2014). БТШ 17.6, ранее выявленный (Zhivetev et al., 2014) при сезонной динамике в октябре и отсутствующий в августе (пробы отбирались в 14 ч) был снова обнаружен нами в образцах, но отобранных после полудня (15 и 20 часов). В холодное время суток БТШ 17.6 не детектировался. Шаперон COR14b, участвующий в защите митохондрий от холодового шока, присутствовал в листьях манжетки городковатой только в 6 часов утра. Таким образом, показан синтез белков теплового шока (БТШ) днем и холодового шока (БХШ) ночью. С этим может быть связано стабильно высокое содержание пиридоксина в листьях манжетки городковатой в течение суток. Более высокие содержания витамина В6 при понижении температуры по-видимому связаны с тем, что при этих условиях адаптивный синтез БХШ ночью важнее синтеза БТШ днем. В то же время, не исключен более высокий синтез пролина в холодное время суток, что также может отражаться на содержании пиридоксина.

Корреляционная зависимость БАВ от изменений температуры в течение суток. Для более глубокого понимания суточного хода температуры на содержание БАВ в листьях манжетки городковатой нами был использован метод корреляционного анализа (табл. 3). С его помощью выявлено, что с понижением температур воздуха достоверно увеличивается содержание витамина С и общего содержания фенольных соединений. Понижение температуры воздуха недостоверно приводило к увеличению содержания пиридоксина и уменьшению РР.

Table 1. Суточная динамика температуры, содержания биологически активных веществ и доли сухого веса в листьях манжетки городковатой в середине октября, р. Выдриная

	Время суток, часы
	600	900	1500	2000	2400
Температура, °С	-3 °С	+1 °С	+9 °С	+5 °С	+1 °С
Общее содержание фенольных соединений, мг/г сухого веса	28.8±1.7	12.7±1.0	4.7±0.2	10.2±0.7	11.0±0.9
Содержание       аскорбиновой кислоты, мкг/г сухого веса	648.2±101.8	65.4±8.9	5.0±0.4	17.6±1.2	48.6±6.1
Содержание РР (витамина B 3 ), мкг/г сухого веса	3.1±0.4	96.1±13.2	174.5±13.4	2.2±0.1	6.7±0.8
Содержание витамина B 6, мкг/г сухого веса	328.7±51.,6	216.2±29.7	217.9±16.7	259.0±17.1	312.6±39.0
Доля сухого вещества, доли ед.	0.19±0.03	0.20±0.03	0.30±0.02	0.27±0.02	0.28±0.03

Table 2. Содержание стрессовых белков в листьях манжетки городковатой в течение суток14–15 октября, р. Выдриная (у.е. или нг белка)

Стрессовый белок	Время суток, часы
	600	900	1500	2000	2400
БТШ 70	8457 ± 372	14623 ± 223	18394 ± 354	12897 ± 424	8393 ± 314
БТШ 60	7240 ± 73	9721 ± 121	13377 ± 110	9369 ± 46	6282 ± 132
БТШ 101	0	0	0	0	0
БТШ 17,6	0	0	11793 ± 203	6643 ± 324	0
COR 14 b	11702 ± 132	0	0	0	0

Примечание: БТШ – белки теплового шока; COR – cold regulated protein

Table 3. Корреляционные зависимости содержания биологически активных веществ с температурой и долей сухого веса

Сравниваемые характеристики	Корреляция по Спирману
	с темпе	ратурой	с долей сухого веса
	R	p	R	p
Фенольные соединения	-0.975	0.005	-0.900	0.037
Витамин В 6	-0.564	0.322	-0.300	0.624
Витамин С	-0.975	0.005	-0.900	0.037
Витамин РР	0.360	0.553	0.500	0.391
Доля сухого веса	0.821	0.089	1.000	0.000
Температура	1.000	0.000	0.821	0.089

Примечание: R – коэффициент корреляции, p - уровень значимости

Увеличение температуры в течение суток закономерно приводило к увеличению доли сухого веса, но сопровождалось уменьшением концентрации БАВ, за исключение витамина РР.

CONCLUSIONS

Таким образом, в результате исследований круглосуточной динамики содержания фенолов, витаминов В6, С и РР в тканях листьев манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser была показана реализация адаптационного потенциала травянистых растений в естественных условиях в течение короткого периода времени при воздействии резкой смены температурных условий. Был выявлен максимум содержания фенолов и витамина С в 6 ч, которые по всей видимости задействованы в адаптации растительных клеток к утреннему минимуму суточной температуры. Устойчивость к гипотермии ночью главным образом может реализовываться за счет активного участия этих соединений в окислительных и антиоксидантных процессах. В то же время, выраженная суточная динамика содержания пролина и витамина РР, активно участвующих в белковом обмене, вместе с закономерным изменением в составе и содержании БТШ и шаперонов, свидетельствует о более тонкой регуляции белкового обмена в течение суток, чем могло предполагаться ранее. Как известно, в модельных экспериментах накопление БТШ обычно регистрируют уже через несколько часов после стрессового воздействия. Полученных результаты показывают, как это происходит в естественных условиях. Причем увеличение содержания стрессовых белков, защищающих от гипертермии, сопряжено с уменьшением содержания белков, защищающих от холода, что очевидно связано с комплексом ограничивающих растительную клетку факторов.

ACKNOWLEDGMENT

Работа выполнена при поддержке Интеграционной программы «Фундаментальные исследования и прорывные технологии как основа опережающего развития Байкальского региона и его межрегиональных связей».