ДНК-диагностика в селекции крупного рогатого скота

• –    встречаемость мутантных аллелей гена BLAD (дефицита лейкоцитарной адгезии), в гомозиготном состоянии приводящих к гибели эмбрионов;

• –    частоты носительства мутантных аллелей гена FXI, приводящих в гомозиготном состоянии к продолжительным кровотечениям, анемии и нарушениям воспроизводства;

• –    частоты В-аллеля гена κ-казеина, обусловливающего более высокие технологические качества молока, используемого в сыроделии;

• –    частоты носителей вируса лейкоза;

• –    частоты носительства КРС возбудителя туберкулёза.

В настоящем сообщении изложены первые результаты исследований выполненных лабораторией генетики ИНИИИЦ ОрёлГАУ в 2010-2011 годах.

Материалы и методы исследований

Наследственность сельскохозяйственных животных, как и всех остальных организмов, подвержена спонтанному мутационному процессу. Интенсивность мутагенеза может существенно возрастать в условиях антропогенного загрязнения окружающей среды . Рецессивные мутации, снижающие жизнеспособность организмов или приводящие в гомозиготном состоянии к гибели, в гетерозиготном состоянии могут длительное время сохраняться в популяциях. При определённых системах скрещивания эти мутации будут выщепляться в виде гомозигот. Гибель гомозиготных особей может наносить существенный экономический урон животноводству. Поэтому разработка методов выявления и отбора животных, являющихся носителями вредных мутаций, представляет собой серьёзную теоретическую и практическую задачу.

С использованием молекулярно-генетических методов был исследован крупный рогатый скот следующих хозяйств: АОА ПЗ «Сергиевский», Ливенского р-на; АОНП «Успенское», Ливенского р-на; ЗАО «Березки», Орловского р-на; ЗАО «Куракинское МТФ», Свердловского р-на; Колхоз «50 лет октября», Ливенского р-на; КФК Коськина В.В., Болховского р-на; ОАО «Орловская Нива» СП «Сабурово»; ОАО «Орловское» по племенной работе Орловского р-на; ОАО «ПЗ им. А.С. Георгиевского», Ливенского р-на; ООО «Коротыш», Ливенского р-на;

ООО «Урицкий агрокомплекс», Урицкого р-на; ОПХ «Стрелецкий», Орловского р-на; ОПХ «Красная звезда», Орловского р-на; СХ ИНВЕСТ СП «Никольское» Ливенского р-на; ТВ «Речица», Ливенского р-на.

Материалом для исследований служила кровь , отбираемая из яремной вены в вакуумные пробирки с цитратом натрия. Молекулярно генетические исследования выполнены в соответствии с методическими рекомендациями Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ а [10]. Выделение ДНК осуществляли с помощью набора DIAtom™ DNA Prep100 («БИОКОМ», Россия). ДНК диагностику аллельного полиморфизма генов ESR, RYR, MC4R, каппа-казеина и BLAD осуществляли методом ПЦР- RFLP. Диагностику полиморфизма локуса FXI осуществляли с помощью аллель специфичной ПЦР. Диагностику осуществляли по опубликованным методикам [5, 20, 26]. Возбудителей лейкоза КРС выявляли с помощью тест системы «ЛЕЙКОЗ» (Интерлабсервис, Москва). Возбудителей туберкулёза КРС выявляли с помощью тест системы «Х» («Интерлабсервис», Москва). Амплификацию проводили используя набор реагентов GenPak PCR Core («БИОКОМ», Россия) в термоциклёре MyCycler (BioRad СШ А).

Результаты и обсуждение

В начале нового столетия молекулярная биология сельскохозяйственных животных пополнилась новым направлением исследований, получившим название «геномика молока». Это направление исследует генетические основы химического состава молока. Исследование более 2000

коров позволило генетикам нидерландского университета г. Вахенинген установить, что у разных животных внутри даже одной породы молоко может иметь различные биохимические составы и жиров, и белков. Обусловлено это различиями в генотипах различных животных. Современные методы молекулярной генетики позволяют быстро генотипировать животных обоего пола и целенаправленно проводить подбор родителей для формирования таких стад коров, молоко которых будет отвечать определённым технологическим требованиям по количеству и составу жиров и белков [9].

Поиск генетических маркеров, связанных с белковомолочностью позволил выявить взаимосвязь содержания белка в молоке с аллельным состоянием гена каппа-казеина. Установлено существование, по меньшей мере, 6-и аллелей (А, В, С, Е, F, G) гена каппа-казеина. Разработаны методы их выявления [1, 2, 5, 11, 12, 15].

Частоты встречаемости аллелей каппа-казеина в разных породах различаются . Частота предпочтительного для сыроделия аллеля В была минимальной (12,96%) у черно-пестрой породы, и максимальной у швицкой породы (65,28%). Наряду с основными аллелями каппа-казеина А и В в некоторых породах выявлены редкие аллели С, Е, F, G. Относительно высокая частота встречаемости аллеля Е (7,21%) была обнаружена в популяции КРС горбатовской породы. Максимальное число различных генотипов установлено у животных красной горбатовской (8; АА, АВ, ВВ, АЕ, BE, ЕЕ, BF, ВС) и швицкой – (7; АА, АВ, ВВ, BF, ВС, AC, AG) пород. Наименьшим генетическим разнообразием (по три генотипа) характеризуются коровы черно-пестрой (АА, АВ, АЕ) и якутской пород (АА, АВ, ВВ) [1]. Существенные различия по частоте встречаемости аллелей А и В κ-казеина обнаружены между фризским и польским красным скотом [21].

Аллель CSN3В ассоциирован с более высоким содержанием белка в молоке [23]. Молоко, полученное от животных с генотипом CSN3ВВ, имеет преимущество по технологическим параметрам для производства белковомолочных продуктов [4]. Показано, что белок каппа-казеина, контролируемый аллелем CSN3В, имеет ряд отличительных особенностей по сравнению с аллелем CSN3А: установлены различия в размере мицелл, более высокое содержание протеина, большая стабильность при нагревании и замораживании, лучшие свойства для сыроделия (более короткое время коагуляции, коагулят более плотной консистенции, более высокий выход сыра – на 5-10%). Ж ивотные с гомозиготным генотипом CSN3ВВ имеют превосходство по содержанию белка на 0,2-0,4% [3, 6, 8]. В ряде стран запись результата ДНК-тестирования по гену CSN3 в племенных картах животных является обязательной [4]. Данные о связи молочной продуктивности КРС и генотипической структуры локуса CSN3 подтверждены белорусскими исследователями [14]

Аллель А сайта рестрикции для рестриктазы Hind III не имеет, поэтому после рестрикции аллели А изначальный ПЦР продукт размером 532 пн остаётся неизменным . Аллель В имеет сайт рестрикции для рестриктазы Hind III, поэтому в результате рестрикции ПЦР фрагмент размером 532 пн «разрезается» на два фрагмента: 377 и 155 пн. Присутствие трёх фрагментов на геле после рестрикции (ПЦР фрагмента размером 532 пн, говорящего о присутствии аллеля А, и фрагментов 377 и 155 пн, свидетельствующих о присутствии аллеля В) говорит о том, что данный генотип гетерозиготен и имеет обе аллели (рис.).

AB AB AB ДА АД ДА АЛ ДВ ДА АА BQ пи                     ПП        rVI Га U        ГАГА

Рисунок – Электрофореграмма генотипирования по гену каппа-казеина (внизу указаны генотипы, справа – размеры фрагментов, п.н.)

При анализе полиморфизма гена каппа-казеина нами обнаружены животные гомозиготные по А аллелю (59 особей), гомозиготные по В аллелю (3 особи) и гетерозиготы (22). У симменталов (4 особи) были обнаружены только АА генотипы. У коров чёрно-пёстрой породы (8), голштинизированной чёрно пёстрой породы (61) обнаружены АА и АВ генотипы . Особи с генотипом ВВ обнаружены только среди гибридов симменталов и чёрно-пёстрой породы

(проанализировано 11 особей), равно как и АА и АВ генотипы . Таким образом, частота встречаемости В аллеля у проанализированных особей КРС Орловской области (большинство которых представлены чёрнопёстрым голштинизированным скотом) составила – 16,7%, частота встречаемости генотипов АВ – 26%, и генотипов ВВ – 3,6%. Наблюдаемые частоты генотипов статистически достоверно (Р≤0,01) отличаются от теоретически ожидаемых: ярко выражен недостаток гетерозигот и гомозигот по аллелю В. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Зиновьевой с соавт. [2005], установившими низкую частоту встречаемости В-аллеля в стадах чёрно пёстрой и голштинской чёрно-пёстрой породы, варьировавшую от 4,8 до 20 %. Одной из причин несоответствия наблюдаемого распределения аллелей и теоретически ожидаемого может быть отбор на признак сцеплено наследуемый и, таким образом , связанный с преобладающим аллелем .

У коров швицкой породы молочного типа установлена связь генотипа ВВ с молочной продуктивностью: удоем (ВВ>АА, +1065кг, Р>0,95), молочным жиром (ВВ>АА, +42,1кг, Р>0,95), процентным содержанием жира (ВВ>АВ, +0,07%, Р>0,95) и белка (ВВ>АВ, +0,04%, Р>0,99 и ВВ>АА, +0,07%, Р>0,99). Также выявлено положительное влияние аллеля Е и отрицательное влияние аллелей G и F гена каппа-казеина на удой [1].

Таким образом, исследование полиморфизма гена каппа-казеина позволит провести целенаправленную селекцию и создать стада животных, молоко которых будет использоваться преимущественно для получения сыров.

BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency) – дефицит лейкоцитарной адгезии (генетически обусловленный иммунодефицит), наследственное аутосомно-рецессивное заболевание КРС голштинской породы , которое приводит во многих случаях к ранней смерти телят.

Заболевание обусловлено точечной мутацией в положении 383 гена CD18. Мутация приводит к замене гуанина на аденин и изменению глицина на аспарагиновую кислоту (в позиции 128). В результате, CD11B/CD18-интегрин (поверхностный клеточный рецептор, взаимодействующий с внеклеточным матриксом и передающий различные межклеточные сигналы) не работает. У больных животных происходят рецидивирующие бактериальные инфекции, замедляется заживление ран, задерживается рост, и наступает ранняя смерть . Многие экономически развитые страны мира осуществляют программу выявления носителей мутации путём ДНК-тестирования. Цель этих программ – не допустить к воспроизводству быков гетерозиготных по данной мутации.

Нами исследована кровь 23 голов КРС. Диагноз поставлен для 18 животных (5 анализов были забракованы по техническим причинам). Носители мутации не были обнаружены (табл. 1).

Таблица 1 – Частоты различных генотипов локуса κ-казеина у проанализированных животных

Хозяйство	Кол-во голов	Генотипы по к-казеину
		АА	АВ	ВВ
ОАО «Орловское» по племенной работе Орловский р-он	13	9	3	1
СХ ИНВЕСТ СП «Никольское» Ливенский р-он	9	3	4	2
ОПХ «Стрелецкий», Орловский р-он	39	32	7	-
ОПХ «Красная звезда», Орловский р-он	23	15	8	-
Всего	84	59 (70,2)	22 (26,2%)	3 (3,6%)

Аналогичные результаты были получены мексиканскими исследователями. Большинство быков-производителей, эксплуатируемых в Мексике, происходят из стад КРС СШ А, в которых BLAD-скриниговая программа действует с 90-х годов прошлого столетия . По этим причинам среди 61 проанализированного животного голштинской породы мутация не была обнаружена. Исследователи указывают, что такой благоприятный результат получен в результате интенсивной скрининговой программы, выполненной в СШ А, позволившей ликвидировать заболевание в популяции голштинского скота и в Мексике [27].

В перспективе следует подвергать тестированию на носительство мутаций в локусе BLAD всех животных, используемых для воспроизводства стад Орловской области.

Таблица 2 – Результаты исследования КРС на носительство дефицита лейкоцитарной адгезии BLAD

Хозяйство	Исследовано голов	Диагностировано
		Здоровые	Носители
ОАО «Орловское» по племенной работе, Орловский р-он	13	8	–
СХ ИНВЕСТ СП «Никольское» Ливенский р-он	10	10	–
Всего	23	18	–

Фактор ХI (плазменный предшественник тромбопластина) является гликопротеином, синтезируется в печени и участвует в ранней фазе свертывания крови. Наследственное заболевание , известное как дефицит фактора ХI было обнаружено у людей, собак и КРС. У человека это заболевание приводит к нарушению процесса свёртывания крови (гемофилии С) с возникновением соответствующих клинических симптомов повышенной кровоточивости. У КРС животные с дефицитом фактора ХI могут страдать продолжительным кровотечением , анемией, нарушением воспроизводства [19]. У гомозиготных особей наблюдается состояние подобное мягкой форме гемофилии [24].

Наследуемый дефицит фактора XI обнаружили у КРС голштино-фризской породы. Установлено, что дефицит фактора ХI может быть вызван, как минимум , двумя разными мутациями, локализованными в 12-ом и 9-ом экзонах. К концу 2008 года мутация в 9-ом экзоне была найдена только в японской черной породе крупного рогатого скота. Тестирование 100 голштинов и 52 симменталов в Чехии показало отсутствие мутаций в 9-ом экзоне гена FXI [17].

Заболевание животных, поражённых дефицитом фактора XI, в одних случаях может протекать бессимптомно. В других случаях у них может проявляться такие симптомы , как длительное кровотечение после инъекции, продуцирование молока с кровью, и анемия [16]. Кроме того, пониженная частота гомозиготных и гетерозиготных животных может свидетельствовать о гибели части этих генотипов в период эмбрионального развития и в период раннего постнатального онтогенеза, а также о повышенной их восприимчивости к инфекционным заболеваниям [22]. Следовательно, это наследственное заболевание может иметь отрицательный экономический эффект и поэтому необходимы мероприятия, препятствующие его распространению среди животных Орловской области.

Результаты исследований, выполненные нами (табл. 3) свидетельствуют об отсутствии вредных аллелей у проанализированных 23 животных.

Таблица 3 – Результаты исследования КРС на носительство фактора FXI

Хозяйство	Кол-во голов	Здоровые	Носители
ОАО «Орловское» по племенной работе Орловский р-он	13	13	–
СХ ИНВЕСТ СП «Никольское» Ливенский р-он	10	10	–
Всего	23	23	–

Исследование 307 голов КРС голштинской породы и 259 буйволов, проведённое индийскими исследователями [25], а также исследование 330 голштинских и аборигенных коров из иранского Хузестана (Khuzestan, Iran) [18] показало отсутствие мутантных аллелей гена фактора XI у этих животных. Тем не менее , авторы обоих исследований указывают на необходимость систематического обследования стад КРС для обнаружения и элиминации этой летальной мутации. Необходимость таких исследований доказывают факты обнаружения носителей мутаций в европейских популяций КРС. Так, Čítek J. et al. [17] обследовав 279 голов голштинской, 30 голов симментальской пород на носительство мутаций в 12-ом экзоне гена FXI, обнаружили одного гетерозиготного носителя (голштинскую корову). Ещё более высокая частота носителей мутации была обнаружена у польских голштин-фризов: из 140 проанализированных животных 3 родственных коровы (2,24%) оказались носителями мутации.

Существование мутантных аллелей в гене фактора XI европейских пород КРС делает необходимым продолжение обследований Орловского скота на носительство мутаций в этом локусе .

Врождённая высокая резистентность или восприимчивость животных к возбудителям обусловлена наследственностью. Возможность ранней диагностики животных-носителей возбудителей болезни позволяет животноводам не только бороться с угрозой эпидемий и эпизоотий, но и вести селекцию животных резистентных к возбудителям заболеваний. Поэтому это направление ДНК-диагностики также включено в круг исследований лаборатории генетики ИНИИЦ .

Лейкоз крупного рогатого скота – хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основной причиной которой – злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли. Возбудителем инфекции является вирус лейкоза крупного рогатого скота – Bovine leukemia virus, относящийся к семейству Retroviridae, роду Deltaretrovirus. Больными признают животных при положительной реакции на лейкоз с подтверждением диагноза при гематологическом исследовании или имеющих опухолевые признаки болезни.

Рост заболеваемости лейкозом и наносимый им экономический ущерб заставляют искать новые , эффективные подходы к решению проблемы отбора и производства крупного рогатого скота с повышенной резистентностью к возбудителю лейкоза. Перспективным является выяснение механизмов генетической резистентности КРС к вирусу лейкоза. Молекулярные биологи считают очень информативным для решения этих вопросов метод, основанный на анализе связей между полиморфизмом генов-кандидатов и характерных фенотипических проявлений у животного с использованием однонуклеотидных полиморфных маркеров. Во многих лабораториях специалисты ведут поиск различных вариантов генов, которые могут прямо или косвенно способствовать борьбе с инфекцией. В организме инфицированного животного вирусы могут претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности и преодоление защитных механизмов хозяина. По этой причине , желательно наряду с генетическим статусом хозяина изучать и генетическую изменчивость самого возбудителя. Изучение полиморфизма генов хозяина и паразита в их комбинациях на уровне индивидуальных геномов открывает новые возможности в понимании молекулярно-генетических механизмов развития патологий [13].

Лейкоз КРС является одним из инфекционных заболеваний, для диагностики которого разработана методика ДНК-анализа. Для выполнения любых мер по селекции скота на резистентность к возбудителю лейкоза, прежде всего, было необходимо освоить методы его ДНК-диагностики и хотя бы ориентировочно определить частоту носителей вируса в различных хозяйствах Орловской области. Первые результаты исследований в этом направлении были получены. Они представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Результаты исследования КРС Орловской области на носительство возбудителя лейкоза

Хозяйство	Кол-во голов	Здоровые	Больные
ОАО «Орловское» по племенной работе, Орловский р-он	13	13	0
СХ ИНВЕСТ СП «Никольское», Ливенский р-он	22	15	7
ОПХ «Стрелецкий», Орловский р-он	64	35	29
ОПХ «Красная звезда», Орловский р-он	35	14	21
КФК Коськина В.В., Болховский р-он	40	40	0
АОНП «Успенское», Ливенский р-он	20	20	0
АОА ПЗ «Сергиевский», Ливенский р-он	20	16	4
ООО «Коротыш», Ливенский р-он	10	0	10
Колхоз «50 лет октября», Ливенский р-он	15	14	1
ОАО «ПЗ им. А.С. Георгиевского», Ливенский р-он	10	9	1
ТВ «Речица», Ливенский р-он	15	14	1
ОАО «Орловская Нива» СП «Сабурово»	6	6	0
ОПХ «Стрелецкий», отд. Истомино, Орловский р-он	15	15	0
ЗАО «Березки»	10	10	0
Всего	295	221	74

Из проанализированных 295 животных 74 (25%) оказались инфицированными вирусом лейкоза. Следует обратить внимание на то факт, что лейкоз обнаружен практически во всех хозяйствах, где объём выборки превышает 15 голов. Следовательно, вирус широко распространён в хозяйствах Орловской области. Поэтому наряду с профилактическими ветеринарными мероприятиями следует вести селекционную работу по усилению резистентности КРС Орловской области к лейкозу. В настоящее время разработаны методы молекулярногенетического анализа генов главного комплекса гистосовместимости, отвечающих за иммунитет. С помощью этих анализов можно выделить животных, геном которых содержит аллели гена BoLA-DRB3, определяющие генетическую устойчивость или восприимчивость к лейкозу. Внедрение этих методов анализа в селекционную практику в Орловской области – важная перспективная задача лаборатории генетики

Туберкулез – тяжелая хроническая болезнь , которая поражает не только КРС, но и человека. 66

Туберкулез КРС причиняет животноводству серьезный экономический ущерб, обусловленный снижением продуктивности, преждевременной выбраковкой и сдачей крупного рогатого скота на убой.

Возбудители туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis и M. bovis. К роду микобактерий относят более 30 различных видов патогенных и непатогенных микроорганизмов. В природе кроме туберкулезных бактерий существуют условнопатогенные, атипичные и сапрофитные микобактерии. Ж ивотные, инфицированные ими, могут реагировать на туберкулин для крупного рогатого скота, что вызывает трудности при иммунологической диагностике туберкулеза. Возбудитель выделяется из организма с каловым массами, мочой, молоком, мокротой, выдыхаемым воздухом, с истечениями из пораженных полостей.

Восприимчивость к туберкулезу зависит от условий содержания и кормления животных. Сильно влияет на резистентность организма к туберкулезу недостаток в рационе белка, витаминов, солей. Телята заболевают туберкулезом при выпаивании им сырого молока и обрата от туберкулезных коров. Для профилактики туберкулёза ежегодно перед выходом на пастбище необходимо проводить обследование скота на предмет заболевания туберкулезом .

Существенную помощь в диагностике туберкулёза может оказать метод ПЦР-диагностики. С этой целью нами были выполнены анализы КРС трёх хозяйств Орловской области на носительство возбудителя туберкулёза. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Таблица 5 – Результаты исследования КРС на носительство возбудителей туберкулёза

Хозяйство	Порода КРС	о m m о о 5 ° S	X о S m m	X о О S
ОАО «Орловская Нива» СП «Сабурово»	Чёрно-пёстрая	5	5	–
ООО «Урицкий агрокомплекс»	Чёрно-пёстрая	10	10	–
ЗАО» Куракинское МТФ» Свердловский р-он	Чёрно-пёстрая, чёрно-пёстрая голштинизированная	15	15	–
Всего		30	30	–

На предмет носительства животными возбудителя туберкулёза проанализировано 30 голов. Носители возбудителя туберкулеза не выявлены. Объём полученных данных пока не позволяет судить о широте распространения возбудителя туберкулёза, но факт возможности диагностики заболевания позволяет планировать практические мероприятия в направлении формирования генетически обусловленной резистентности крупного рогатого скота Орловской области к туберкулёзу.

Выводы

У исследованных 23 голов КРС из ОАО «Орловское» по племенной работе и СХ ИНВЕСТ СП «Никольское» носителей вредных аллелей дефицита лейкоцитарной адгезии в локусе BLAD не обнаружено.

У исследованных 23 голов КРС из ОАО «Орловское» по племенной работе и СХ ИНВЕСТ СП «Никольское» носителей вредных аллелей в локусе белка FXI не обнаружено.

У 84 исследованных коров ОАО «Орловское» по племенной работе (Орловский р-он), СХ ИНВЕСТ СП «Никольское» (Ливенский р-он), ОПХ «Стрелецкий» (Орловский р-он), ОПХ «Красная звезда» (Орловский р-он) установлены генотипы по локусу к-казеина. Обнаружено 59 (70,2%) животных с генотипом АА. Три животных (3,6%) имели генотип ВВ и 22 (26,2%) животных – генотип АВ.

Для выявления лейкозовосприимчивых животных проведён анализ 295 голов. Определены 74 (25%) животных-носителей вируса лейкоза и 221 животное (75%), не заражённых вирусом. Инфицирование животных вирусом лейкоза обнаружено практически во всех хозяйствах, объём выборки из которых превышает 15 голов. Следовательно, вирус очень широко распространён в хозяйствах Орловской области. Поэтому наряду с профилактическими ветеринарными мероприятиями следует вести селекционную работу по усилению резистентности КРС Орловской области к лейкозу.

Исследованы 30 голов КРС на заражённость возбудителями туберкулёза. Больных животных не выявлено. Внедрение этого метода диагностики в селекционную практику позволит вести отбор животных на врождённую устойчивость к возбудителям туберкулёза.