Добавки на основе амаранта багряного (Amaranthus cruentus L.) для усиления метаногенеза при биоконверсии органических отходов

Метановое брожение, или биометаногенез, — известный процесс превращения биомассы в энергию (1). Образование биогаза (смесь, состоящая приблизительно из 65 % СH4, 30 % CO2, 1 % Н2S и незначительных количеств N2, O2, H2, CO) осуществляется в анаэробных условиях многокомпонентным микробным консорциумом, особенность которого заключается в способности конвертировать в биогаз практически все классы органических соединений, бытовые, сельскохозяйственные и некоторые

Работа выполнена при финансовой поддержке программы ¹ 3 Президиума РАН и гранта РФФИ ¹ 1408-31768.

промышленные отходы (2). Метаногенез осуществляют крайне специализированные прокариоты — очень древние архебактерии, или археи, родов Methanobacterium , Methanosaeta ( Methanothrix ), Methanococcus , Methanosarcina , Methanocorpusculum , Methanobrevibacteria и Methanopyrus (3-6).

Анализ состояния работ по получению биогаза (7-10) показывает, что задача интенсификации метанового сбраживания органического сырья сохраняет актуальность. Одно из перспективных направлений — поиск растительных стимуляторов и ингибиторов метаногенеза. Так, было выполнено сравнение состава летучих жирных кислот (ЛЖК) и выхода биогаза под влиянием 13 растительных экстрактов, выбранных по наивысшей флавоноидной активности (11) (сбраживали смесь экстракта из травяной фитомассы и ячменного зерна в соотношении 50:50). Эксперименты показали, что экстракты из Lavandula officinalis и Solidago virgaurea стимулируют брожения, а из Equisetum arvense и Salvia officinalis — ингибируют выработку метана. Вызывает интерес работа, посвященная изучению действия экстрактов травянистых растений (21 вид) на метаногенез, на грамполо-жительные и грамотрицательные бактерии, их антимикробный потенциал, а также деструкцию сухого вещества in vitro (12). Экстракты получали с помощью метанола, ацетона или воды и определяли содержание в них общих сахаров, танинов и сапонинов. Антимикробный потенциал оценивали на грамположительных стрептококках и стафилококках и грамотрицатель-ных бактериях Esherichia coli и Enterobacter . Ацетоновый и метанольный экстракты из Eucalyptus globulus и водный экстракт из Sapindus mukorossi и E . globulus ингибировали метаногенез in vitro. При изучении влияния богатых сапонинами экстрактов из листьев Carduus, Sesbania и Knautia , а также из семян пажитника сенного ( Trigonella foenum-graecum ) на брожение в рубце, выделение метана и микробное сообщество (13) показано, что сапонины, обладая антипротозойной активностью, не угнетают метаногенез. Сапонины семян пажитника повышают активность содержимого рубца и влияют на микробное сообщество, усиливая рост бактерий, расщепляющих волокна, и подавляя рост популяции грибов.

Для повышения производительности метантенков также широко практикуется добавление в осадок очистных сооружений различной растительной биомассы (14). Добавление косубстратов, например навоза, позволяет обогатить бедный по углероду субстрат органическим веществом. Более 50 % получаемого биогаза в Европе основано на использовании растений (15, 16). Поиск косубстратов для эффективной биоконверсии органических отходов сельского хозяйства и городских стоков в биогаз с высоким содержанием метана остается актуальной задачей.

Нами впервые в качестве косубстратов изучены фитомасса и жом культурного амаранта, полученный после извлечения всех практически ценных веществ, и определено его оптимальное соотношение с субстратом (осадок городских сточных вод), усиливающее образование биогаза и метановое брожение.

Целью работы была оценка влияния добавок на основе амаранта багряного на эффективность конверсии осадочного ила очистных сооружений и органических отходов в биогаз с высоким содержанием метана.

Методика. В качестве субстрата использовали осадок сточных вод (ОСВ, влажность 80,4 %; уплотненный ОСВ, влажность 98,4 %; ОСВ после фильтр-пресса, влажность 45,0 %) г. Казани, косубстрата — фитомассу, жом, образующийся после комплексной переработки (выделения пектинов, рутина и растительного белка), и экстракты (спиртовой, дихлорметановый и водный) жома амаранта ( Amaranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка. В суб-210

страте и косубстрате определяли элементный состав (С, Н, N и S) на анализаторе CHN-3 (ОКБА НПО «Химавтоматика», Россия); стандартом служил стрептоцид (С — 41,85 %, Н — 4,65 %, N — 16,26 %, S — 18,58 %).

В экспериментах варьировали вид субстрата, вид косубстрата, соотношение субстрата и косубстрата, температуру инкубации. Ферментацию проводили в лабораторных реакторах, состоящих из водяной бани LB-160 и погружного термостата-циркулятора LT-100 (бутыли из стекла МТО БКЗ-50, V = 500 мл) («LOIP», Россия).

При сравнении метанообразования в зависимости от доли косуб-страта в смеси с ОСВ (24, 52, 74 и 87 % по абсолютно-сухой массе, рассчитанной с учетом влажности ОСВ и косубстрата) использовали высушенную фитомассу амаранта; ко всем образцам добавляли 100,5 г уплотненного ОСВ, ферментацию проводили при 37 °С. Воздействие мезофильного (37 °С) и термофильного (50 °С) режимов инкубации исследовали при сбраживании ОСВ после фильтр-пресса (количество субстрата — 50,0 г с добавлением 100 мл дистиллированной воды). В том же опыте изучили влияние амарантового жома как косубстрата на эффективность мезофильной (37 °С) ферментации (количество субстрата — 22,5 г, жома с влажностью 9,2 % — 16,7 г; 100 мл дистиллированной воды). При определении эффекта экстрактов жома к субстрату (смесь 37,5 г ОСВ и 105,0 г уплотненного ОСВ) добавляли 0,2 г дихлорметанового (CH2Cl2), 0,2 г спиртового (EtOH) или 2,3 г водного экстракта амаранта (экстракты были получены упариванием досуха в ротационном испарителе ИР-1ЛТ, Россия); для сравнения экстракты заменяли жомом амаранта (5,0 г) (инкубация при 37 °С).

Объем выделяемого биогаза определяли ежесуточно волюмометриче-ски (17). Содержание метана в пробах контролировали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) (CHROM-5, «Laboratorn i p fi stroje», Чехия, колонка 2,4 м с наполнителем Porapak Q, 80-100 меш, «Sigma-Aldrich Co.», США; 80 °С; детектор по теплопроводности, газ-носитель гелий).

Изменение состава микроорганизмов в процессе сбраживания ОСВ выявляли при культивировании на средах для метаногенов (18) и окрашивании по Граму с микрокопированием (МБИ-15, АО «ЛОМО», Россия).

Данные обрабатывали в программе Origin 6.1 . В таблицах и на рисунках приведены средние (M) и стандартные ошибки средних (±SEM). Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р = 0,05.

Результаты. Выбор амаранта Amaranthus cruentus обусловлен тем, что у этой культуры, имеющей высокую урожайность, биомасса с высоким содержанием белка (19-21) служит промышленно воспроизводимым растительным сырьем. Нами в цикле исследований разработаны оригинальные способы и схема получения рутина, растительного белка и пектина при комплексной переработке амаранта (20) на основе экстрактивного извлечения из высушенной фитомассы в едином технологическом цикле.

1. Элементный состав осадка сточных вод (ОСВ), фитомассы и жома амаранта ( Amaranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка, использованных при лабораторном моделировании производства биогаза

Субстрат, косубстрат	C, %	H, %	N, %	С/N
Уплотненный ОСВ	34,65	6,20	7,15	4,9
ОСВ	39,82	7,05	5,81	6,9
Фитомасса амаранта	36,98	4,67	3,47	10,7
Жом амаранта	42,11	6,42	5,20	8,1

Характеристика использованных в эксперименте субстратов и ко- субстратов приведена в таблицах 1 и 2. Процесс метаногенеза моделировали в лабораторных условиях, используя биореактор (рис. 1).

• 2.    Характеристика субстратов с разным содержанием высушенной фитомассы амаранта ( Amaranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка, использованных при лабораторном моделировании производства биогаза ( n = 3, M ±SEM)

  Доля амаранта, %	Сухое вещество, г	Органическое сухое вещество, г	Влажность, %
  24	11,2±0,34	7,3±0,22	92,1±2,76
  52	15,9±0,48	11,3±0,34	89,0±2,67
  74	18,1±0,54	13,7±0,41	86,7±2,60
  87	21,5±0,65	16,9±0,51	83,2±2,50

  

  Рис. 1. Лабораторная установка для получения биогаза (V = 500 мл, «LOIP», Россия).

  
  

Кинетика выделения CH4 при добавлении 24, 52, 74 и 87 % сухой фитомассы амаранта в качестве косубстра-та (рис. 2) свидетельствовала о наибольшем повышении выхода биогаза в варианте с 24 % (291,1 мл/г сухого вещества, достоверно при р = 0,05). Эффект сохранялся в течение 50 сут (табл. 3), содержание CH4 в биогазе составляло при этом около 60 % (см. рис. 2). Более объективным критерием эффективности процесса служит удельный выход биогаза при пересчете на содержание органического сухого вещества в субстрате, ко- торый также оказался высоким (см. табл. 3).

7 15 22 28 41 50 57 63 78 84 104 111 117 124 132 138

Продолжительность процесса, сут

Рис. 2. Кинетика выделения CH 4 при биоконверсии осадка городских сточных вод в зависимости от содержания сухой фитомассы амаранта ( Amaranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка в субстрате: 1 — 24 %, 2 — 52 %, 3 — 74 %, 4 — 87 % (среднее для 3 повторностей, лабораторный опыт).

Добавление 52 % амаранта приводило к выходу биогаза 226,6 мл/г сухого вещества (достоверно при р = 0,05). Выделение биогаза происходило в тече- ние 138 сут, а содержание метана при этом составляло примерно 55 % (см. рис. 2).

• 3.    Продукция биогаза при биоконверсии осадка городских сточных вод в зависимости от содержания сухой фитомассы амаранта ( Amaranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка в субстрате ( n = 3, M ±SEM, достоверно при уровне значимости 5 %, лабораторный опыт)

Доля амаранта, %	Удельный выход
	мл газа/мл субстрата	мл газа/г сухого вещества	мл газа/г органического сухого вещества
24	23,0±1,15а	291,1±14,60	445,1±22,26
52	24,9±1,25а	226,6±11,33	318,5±15,93
74	17,0±0,85	127,8±6,39	168,4±8,42
87	4,7±0,24	29,1±1,46	36,9±1,85

П рим еч а ни е. Между вариантами, помеченными буквой (а), отсутствуют статистически значимые различия при р = 0,05.

При содержании фитомассы амаранта 74 % процесс имел длительную лаг-фазу — активация газообразования происходила только после

110-х сут. Избыток амаранта угнетал метаногенез: удельный выход биогаза составлял 127,8 мл/г сухого вещества (см. табл. 3). При 87 % амаранта содержание метана в биогазе не превышало 30 % (см. рис. 2) при выходе биогаза 29,1 мл/г сухого вещества (достоверно при p = 0,05, см. табл. 3). Соотнесение этих результатов с данными, представленными в таблице 2, показывает, что оптимальная влажность субстрата для метаногенеза — не менее 90 %, и с ее уменьшением газообразование снижалось. Следовательно, добавление фитомассы амаранта к субстрату было эффективно только при определенном количественном соотношении с ОСВ, тогда как при избытке фитомассы амаранта метаногенез подавлялся.

Динамику изменения рН ОСВ при добавлении фитомассы амаранта (52 %) иллюстрирует рисунок 3.

Рис. 3. Повышение кислотности среды при анаэробном сбраживании осадка городских сточных вод с добавлением 52 % сухой фитомассы амаранта ( Amaranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка (среднее для 3 повторностей, лабораторный опыт).

При использовании в качестве косубстрата жома амаранта, образующегося после комплексной переработки и извлечения пектинов, рутина и растительного белка (22, 23), лаг-фаза в мезофильном режиме занимала 30 сут. При достижении максимального суточного выхода биогаза (около 120 мл на 40-е сут) в нем отмечали высокое (60 %) содержание CH4 (рис. 4). Удельная продуктивность в эксперименте составила 134,7 мл/г сухого вещества (достоверно при р = 0,05, табл. 4). В термофильном режиме объем выделяемого биогаза значительно увеличивался: более 20 сут его выход превышал 200 мл. Кроме того, лаг-фаза процесса сокращалась до 14 сут при содержании CH4 в биогазе более 50 % (см. рис. 4).

Рис. 4. Содержание CH 4 в биогазе при разных температурных режимах анаэробного сбраживания осадка городских сточных вод (ОСВ) в присутствии жома амаранта ( Amaranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка: а — ОСВ, мезофильный режим (37 ° С), б — ОСВ, термофильный режим (50 ° С), в — ОСВ, жом, мезофильный режим ( n = 3, р = 0,05, лабораторный опыт).

Удельный выход биогаза составлял 354,0 мл/г сухого вещества (достоверно при р = 0,05), что указывает на преимущество термофильного режима сбраживания ОСВ без добавления амаранта. При добавлении амарантового жома в субстрат выход биогаза в мезофильном режиме повышался (лаг-фаза практически отсутствовала, на 12-е сут количество биогаза достигало 80 мл при содержании CH4 62 %) (см. рис. 4). Только после 60-х сут выход газа уменьшался до 20 мл при содержании CH4 около 60 % до завершения эксперимента. Удельный выход биогаза при добавлении амарантового жома в мезофильном режиме соответствовал ~ 0,25 м3 на 1 кг сухого вещества органического сырья.

• 4.    Продукция биогаза при биоконверсии осадка городских сточных вод (ОСВ) в зависимости от температурного режима и содержания жома амаранта ( Am-aranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка в субстрате ( n = 3, M ±SEM, достоверно при уровне значимости 5 %, лабораторный опыт)

Состав среды	Режим	Удельный выход
		(мл газа/мл субстрата) (мл газа/г сухого вещества)

ОСВ                 Мезофильный, 37 ° С         20,5±1,03^а                 134,7±6,74

ОСВ + жом амаранта  Мезофильный, 37 ° С         22,7±1,14^а                 251,9±12,60

ОСВ Термофильный, 50 ° С         53,1±2,66                  354,0±17,70

П рим еч а ни е. Между вариантами, помеченными буквой (а), отсутствуют статистически значимые различия при р = 0,05.

Рис. 5. Кинетика выделения биогаза при биоконверсии осадка городских сточных вод с добавлением спиртового (1) , дихлорметанового (2) и водного (3) экстрактов и жома амаранта ( Amaranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка (4) (среднее для 3 повторностей, лабораторный опыт).

Дихлорметановый экстракт фитомассы амаранта (22) имеет зеленый цвет благодаря присутствию хлорофилла, водный экстракт содержит углеводы, белки, минеральные соли и амарантин, а этанольный богат фенольными соединениями — рутином и кверцетином. Жом после трех экстракций содержал клетчатку, белок, углеводы и пектины (22). Наблюдаемая кинетика газообразования при мезофильном сбраживании смеси ОСВ и уплотненного ОСВ (рис. 5) подтвердила, что при добавлении экстрактов CH2Cl2 и EtOH к субстрату лаг-фаза сокращалась до 10 сут. Это сопоставимо с действием фитомассы амаранта. Оче- видно, в дихлорметановом и этанольном экстрактах содержатся компоненты, которые либо подвергаются быстрой деструкции под влиянием сообщества микроорганизмов, превращаясь в биогаз, либо способствуют росту биомассы. При добавлении CH2Cl2-экстракта к субстрату наблюдалось наиболее эффективное выделение биогаза, что согласуется с данными литературы (11, 24-27) (табл. 5).

• 5.    Продукция биогаза при биоконверсии осадка городских сточных вод с добавлением разных экстрактов и жома амаранта ( Amaranthus cruentus L.) сорта Дюймовочка ( n = 3, M ±SEM, достоверно при уровне значимости 5 %, лабораторный опыт)

Косубстрат	Удельный выход
	мл газа/мл субстрата	мл газа/г сухого вещества	мл газа/г органического сухого вещества
Экстракт CH2Cl2	16,2±0,81а	266,1±13,31b	433,5±21,68
Экстракт EtOH	14,5±0,73а	236,1±11,81c, d	382,5±19,13e
Водный экстракт	16,6±0,83а	221,8±11,09c	345,8±17,29e
Жом амаранта	23,7±1,19	259,1±12,96b, d	355,4±17,77e

П рим еч а ни е. Между вариантами, помеченными одинаковыми буквами, отсутствуют статистически значимые различия при р = 0,05.

При добавлении жома удельный выход биогаза составил 259,1 мл/г сухого вещества (достоверно при р = 0,05), что сопоставимо с аналогичным показателем (266,1 мл/г сухого вещества) для экстракта, полученного с использованием CH2Cl2, при содержании CH4 на 98-е сут 82,5 % (мак214

симальное значение за весь период исследований. Отметим, что жом амаранта после трех экстракций (см. табл. 5), как и фитомасса амаранта (см. табл. 3), служит активирующим косубстратом метаногенеза (Патент РФ ¹ 2351552). Таким образом, в присутствии амарантового жома продуктивность биометаногенеза в мезофильном режиме тоже возрастала (на 12,8 %, достоверно при р = 0,05), что в целом повышает эффективность комплексной переработки сырья, получаемого при выращивании этой культуры. Представленные результаты указывают на экологическую и экономическую целесообразность использования жома амаранта.

Микробиологическое изучение образцов при анаэробном сбраживании ОСВ показало, что для исходного субстрата характерно присутствие крупных эукариотических форм. В период максимальной активности газообразования (40-е сут) в среде преобладали грамположительные мелкие палочковидные бактерии — как одиночные, так и собранные в длинные цепочки. Очень мелкие одиночные формы были более типичны для питательной среды на основе ацетата. На МПА (18) наблюдали образование гладких и шероховатых колоний. На среде для метаногенов выросло значительное количество очень мелких колоний. Встречались как грамположительные, так и грамотрицательные формы.

Итак, наши исследования показали, что оптимизация субстрата по органическому веществу с использованием фитомассы или жома амаранта позволяет производить биогаз из осадков сточных вод с более высокой эффективностью, решая задачу утилизации отходов и получения топлива из дешевого возобновляемого источника .