Доклиническое исследование лекарственной формы (1,2)-L-рамно-(1,4)-D-галактопиранозилуронана из корневищ аира болотного Acorus calamus L. в онкологическом эксперименте

Несмотря на выраженный противоопухолевый эффект химиотерапии, осложнения цитостатического лечения часто становятся показаниями для его прекращения. Для повышения цитотоксического эффекта и снижения повреждающего действия химиопрепаратов на нормальные органы и ткани предпринимаются попытки использования биологически активных соединений растительного происхождения [1]. К числу наиболее распространенных в природе биополимеров относятся полисахариды, отличающиеся разнообразием структурного строения и физико-химических свойств, широким спектром фармакологических эффектов [2].

Ранее в экспериментах нами была показана возможность повышения эффективности химиотерапии полисахаридами аира болотного (Acorus calamus L.) при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении [2], показана возможность коррекции гематологической токсичности, гепатотоксичности, защита слизистой желудочнокишечного тракта при их включении в схемы цитостатической терапии перевиваемых опухолей животных [5–8]. Установлено, что наиболее выраженный терапевтический эффект полисахаридов наблюдается при внутрибрюшинном способе введения, в отличие от внутрижелудочного, при котором наступление фармакологического эффекта лимитируется физиологическими особенностями живого организма, кроме того, он снижается за счет биотрансформации действующего вещества пищеварительными ферментами.

Исследование механизмов противоопухолевой активности α (1,2)-L-рамно- α (1,4)-D-галактопиранозилуронана Acorus calamus L. показало, что специфической мишенью для его воздействия являются антиген-презентирующие клетки (макрофаги, дендритные клетки), которыми богата внутрибрюшинная жидкость, и противоопухолевый эффект реализуется посредством изменения их поляризационного профиля и активацией Th1-типа иммунного ответа [9]. Известно, что концентрация некоторых препаратов в кровеносном русле при внутрибрюшинном способе доставки не многим, но уступает внутривенному пути введения медикаментов, при котором развитие эффекта ввиду поступления лекарства в кровь происходит мгновенно. К тому же внутрибрюшинный путь введения в клинической практике – явление не популярное, используется для профилактики спаечной болезни, изредка – для введения цитостатиков и антибиотиков.

Целью настоящего исследования явилось сравнение эффективности применения α (1,2)-L-рамно- α (1,4)-D-галактопиранозилуронана Acorus calamus L. при внутрибрюшинном и внутривенном пути введения в сочетании с циклофосфаном у мышей с карциномой легкого Льюис (LLC), раком легкого – 67 (РЛ-67) и меланомой В-16 (В-16).

Материал и методы

Экспериментальная партия лекарственной формы α(1,2)-L-рамно-α(1,4)-D-галактопиранозилуронана из корневищ аира болотного ( Асоrus calamus L. ) (1 % стерильный изотонический раствор для инъекций – далее по тексту «препарат») изготовлена в Центре внедрения технологий ГБОУ ВПО «Сибирского государственного медицинского университета» Минздрава (серия 011212 для доклинических исследований). Выделение и стандартизация α(1,2)-L-рамно-α(1,4)-D-галактопиранозилуронана из корневищ аира болотного проводились с использованием методов динамической экстракции, спиртового осаждения, ионообменной хроматографии, фильтрации через полупроницаемую мембрану, лиофильной сушки, хромато-масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии [9].

Эксперименты выполнены на половозрелых мышах-самках линии С57Bl/6 (массой 19–26 г, 2–3 мес), конвенциональных, 1-й категории, разводки отдела экспериментального биомоделирования ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга» (сертификат здоровья лабораторных животных Научного центра биомедицинских технологий № 24–03). Содержание мышей осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Дизайн исследования одобрен Этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга».

Трансплантацию LLC, В-16 и РЛ-67 проводили гомогенатом опухолевой ткани в стерильном физиологическом растворе внутримышечно по 5×106 опухолевых клеток в объеме 0,1 мл. Во всех экспериментах внутривенные и внутрибрюшинные введения препарата по 20 мг/кг начинали с 7-х сут развития опухоли и производили ежедневно в течение 10 сут. На 10-е сут развития опухоли однократно вводили циклофосфан (ЦФ) (ОАО «Биохимик», Россия, г. Саранск) в дозе 125 мг/кг, внутрибрюшинно; эксперимент заканчивали на 21-е сут развития опухоли. Контрольные группы получали физиологический раствор в эквивалентном объеме ежедневно, при этом путь введения чередовали.

По окончании экспериментов мышей умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством здравоохранения РФ. Определяли массу первичной опухоли, подсчитывали количество и площадь метастазов в легких, вычисляли процент торможения роста опухоли, частоту метастазирования и индекс ингибирования метастазирования [4].

Обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических критериев Вилкоксона – Манна – Уитни и углового преобразования Фишера. Различия считали достоверными при р<0,05 [3].

Результаты и обсуждение

На модели карциномы легких Льюис показано, что препарат повышает противоопухолевый

Таблица

Bлияние α(1,2)-L-рамно-α(1,4)-D-галактопиранозилуронана Acorus calamus L. (препарата) на развитие карциномы легкого Льюис, меланомы B-16, рака легкого-67 у мышей линии C57Bl/6 и эффективность терапии циклофосфаном

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (р<0,05) разница с контролем; ** – различия статистически значимы по сравнению с группой ЦФ (р<0,05).

и антиметастатический эффект ЦФ. Так, масса опухоли в группе мышей, которым вводили ЦФ и исследуемый препарат внутривенно, снижалась в 1,5 раза относительно таковой у получавших только ЦФ (таблица). Препарат, используемый совместно с циклофосфаном, вызывал снижение частоты метастазирования у подопытных животных. Так, если при изолированном введении цитостатика этот показатель достигал 62 %, то добавление в схему лечения препарата вызывало его снижение до 15 и 17 % при внутрибрюшинном и внутривенном введении соответственно. Следует отметить тенденцию к снижению среднего количества метастазов и их площади в группах комбинированной терапии.

У мышей с меланомой В-16 препарат, вводимый внутривенно совместно с циклофосфаном, вызывал достоверное снижение частоты метастазирования опухоли. Если цитостатик назначали изолированно, этот показатель составлял 50 %, при этом различие с контрольной группой не было достоверным. В то же время в группе «ЦФ + препарат внутривенно» обнаружено снижение частоты метастазирования до 29 %, при этом разница с группой, леченной только цитостатиком, была статистически значимой.

Наиболее выраженное повышение антиметаста-тического эффекта при включении в схему химиотерапии препарата удалось обнаружить на модели РЛ-67. Внутрибрюшинное введение препарата приводило к снижению частоты метастазирования до 50 % против 90 % в группе изолированной химиотерапии. Лишь у 25 % животных отмечалось метастатическое поражение легочной ткани, если на фоне ЦФ препарат вводили внутривенно. Количество метастазов у мышей с РЛ-67, получавших совместно с ЦФ препарат внутрибрюшинно или внутривенно, достоверно снижалось в 4,6 и 3,7 раза соответственно относительно этого показателя у животных, леченных только ЦФ. Препарат при его внутрибрюшинном и внутривенном введении способствовал не только угнетению процесса диссеминации опухоли, но и тормозил рост уже образовавшихся метастазов, о чем свидетельствует достоверное снижение площади метастатического поражения относительно группы животных, получавших ЦФ.

Таким образом, результаты экспериментов показали, что внутривенное введение препарата по эффективности не уступает внутрибрюшинному, а в некоторых случаях, как, например, в эксперименте на животных с карциномой легких Льюис, даже превосходит. Внутрибрюшинное назначение препарата не повлияло на рост основного опухолевого узла, в то время как внутривенно используемый препарат вызывал достоверное торможение роста опухоли. Внутривенный способ имеет неоспоримые преимущества перед другими способами в связи с быстрым наступлением эффекта, а также обеспечивает максимальную биодоступность препаратов.

Механизм действия препаратов полисахаридной природы реализуется опосредованно, через клетки иммунной системы. При внутрибрюшинном введении лекарственные препараты быстро адсорбируются клетками брюшной полости, в частности макрофагами, которые в кратчайшие сроки запускают цепь специфического противоопухолевого ответа, проникая через стенки брюшины, густо пронизанные кровеносными сосудами. Как известно, биодоступность препаратов при внутривенном введении достигает 100 %. Непосредственное попадание препарата в кровеносное русло также вызывает цепь иммунных реакций, приводящую к реализации терапевтического эффекта препарата [9]. Кроме опосредованных через иммунокомпетентные клетки эффектов, полисахариды способны оказывать прямое влияние на рецепторный аппарат, на поверхностные мембранные структуры клеток, в том числе и опухолевые, что, несомненно, делает внутривенный путь доставки препаратов полисахаридной природы предпочтительным. Так, антиметастатический и противоопухолевый эффект полисахаридов, вероятно, может быть связан с угнетением процесса неоангиогенеза через сигнальные белки VEGF-1 и матричные металлопротеиназы [10, 11]. Проведенное исследование доказывает, что биологическая активность препарата при внутривенном способе доставки не снижается относительно внутрибрюшинного, а также позволяет экстраполировать полученные результаты на ситуацию в клинике и рекомендовать внутривенный путь α(1,2)-L-рамно-α(1,4)-D-галактопиранозилуронана из корневищ аира болотного (Acorus calamus L.) для клинических исследований в качестве основного метода введения.