Доклиническое изучение терапевтической эффективности радиофармацевтического препарата [177Lu]Lu-PSMA I&T

Рак предстательной железы (РПЖ) – со́лидная опухоль у мужчин, которая и до настоящего времени остаётся второй ведущей причиной смерти от рака у мужчин в большинстве стран мира по данным ВОЗ [1, 2]. В настоящее время в мире у пациентов с метастатическим кастрационно-резистентным раком предстательной железы (мКРРПЖ) всё чаще применяется радионуклидная терапия радиофармацевтическими лекарственными препаратами (РФЛП) на основе различных лигандов к простат-специфическому мембранному антигену (ПСМА), меченных 177Lu, например, [177Lu]Lu-PSMA-617 [3].

Клементьева О.Е.* – в.н.с, к.б.н. ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Лунёв А.С. – зав. лаб., к.б.н.; Петросова К.А. – науч. сотр.; Ларенков А.А. – зав. отд., к.х.н. ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России.

Рис. 1. Молекулярная структура PSMA I&T [6].

В Российской Федерации ведутся разработки, доклинические и клинические исследования РФЛП на основе низкомолекулярных лигандов ПСМА, меченных 177Lu [7].

• 1.    Доклиническое изучение эффективности РФЛП [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T путём анализа зависимости «доза-эффект» для двух дозировок радиофармацевтического препарата [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T с активностями, эквивалентными терапевтическим активностям, рекомендованным для человека.

• 2.    Оценка ожидаемых поглощённых доз в экспериментальных опухолевых очагах лабораторных мышей после введения изученных терапевтических активностей [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T при минимальном и максимальном накоплении радиофармпрепарата.

Материалы и методы

Исследуемый радиофармпрепарат: синтез и методы анализа

Синтез лиофилизированной композиции реагентов, РФЛП [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T и его анализ проводили в лаборатории технологии и методов контроля радиофармпрепаратов ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России. РФЛП получали путём добавления раствора ¹⁷⁷Lu без носителя (¹⁷⁷Lu]LuCl 3 в 0,04 М HCl, ≥1850 ГБк/мг, поставлен ООО «ЦМИ-Медицина») к лиофилизированной композиции реагентов, содержащей прекурсор PSMA I&T и функциональные добавки

Моделирование гетеротопических ксенографтов РПЖ человека на лабораторных животных

Для проведения доклинических исследований РФЛП [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T, предназначенного для радиолигандной терапии мКРРПЖ, в качестве модели опухолевого очага был выбран гетеротопический ксенографт PSMA-экспрессирующей аденокарциномы предстательной железы человека линии 22RV1, воспроизведённый на самцах иммунодефицитных мышей линии nu/nu (получены из питомника лабораторных животных «Пущино»). Клеточная культура РПЖ человека линий 22RV1 (РПЖ 22RV1) была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Культивирование необходимого количества клеток и их подготовка к ксенотрансплантации выполнены согласно рекомендациям ATCC. Культивирование осуществляли при 37 ºС в инкубаторе СО 2 с воздушной рубашкой MCO-15АС (Sanyo, Япония).

Инъекцию ∼5⋅106 жизнеспособных опухолевых клеток в 100 мкл смеси ростовой среды RPMI 1640 и Matrigel® (Corning, США) в соотношении 1:1 производили подкожно в область лопатки. Рост и наличие опухолевых очагов контролировали визуально. Опухолевые очаги РПЖ 22RV1 начали визуализироваться и пальпироваться на 26 день после трансплантации клеток. Приживаемость ксенографтов наблюдалась у 80% животных, которым была введена культура клеток 22RV1. Факт воспроизведения модели РПЖ человека в виде подкожных опухолевых очагов РПЖ 22RV1 был подтверждён при гистологическом исследовании.

Формирование экспериментальных групп и дозирование препарата

Оценка терапевтического действия была выполнена на когорте из 30 самцов мышей линии nu/nu с массой тела 25,8±2,9 г с визуально подтверждённым наличием опухолевого очага. Животных распределили в экспериментальные группы из общей когорты случайным образом на 38 день после введения суспензии клеток 22RV1, когда средний объём опухолевых очагов по когорте достиг 220,8±71,1 мм3. Экспериментальные группы сформированы следующим образом: первая опытная группа – животные, которым вводили РФЛП с минимальной активностью (ЭДmin), вторая опытная группа – животные, которым вводили РФЛП с максимальной активностью (ЭДmax), эквивалентным терапевтическим активностям, рекомендованным для человека [8] (28,6 и 114,3 МБк/кг соответственно). Третья группа животных – контрольная, которым РФЛП не вводили. Критерием достижения терапевтического эффекта являлось статистически значимое торможение роста опухоли у животных опытных групп по сравнению с контрольной группой.

Расчёт вводимых дозировок по активности РФЛП проведён с учётом коэффициентов пересчёта человек/экспериментальное животное в соответствии с руководством [9]. Активности РФЛП на одну особь составили: ЭДmin – 9,2 МБк, ЭДmax – 36,6 МБк. РФЛП с объёмными активностями 150 МБк/мл и 600 МБк/мл вводили внутривенно в объёме 0,06 мл.

Расчёт ожидаемых поглощённых доз в опухолевых очагах

Таблица 1

Уровень накопления	Время после введения препарата, ч
	1 ч	3 ч	24 ч	72 ч	168 ч
Минимальный	3,11	4,86	4,00	1,08	0,53
Максимальный	4,53	5,58	5,86	2,06	0,75

• -    опухолевый очаг имеет форму сферы и объём ∼200 мм³;

• -    физическая плотность ткани очага однородна по всему его объёму и близка к плотности воды;

• -    радиофармпрепарат распределяется внутри очага равномерно;

• -    уровни накопления и время удержания радиофармпрепарата в опухолевом очаге не имеют зависимости от введённой активности, так как количество PSMA I&T во всех образцах [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T, использованных в описанных экспериментах, было одинаковым.

Значения резидентного времени и эффективного периода полувыведения РФЛП из опухолевых очагов были рассчитаны с использованием полученных экспериментально данных.

Методика оценки терапевтического действия РФЛП

Критерии оценки терапевтического действия исследованного РФЛП: динамика изменения объёма опухолевых очагов РПЖ 22RV1, торможение роста опухолевых очагов (ТРО, %) в опытных группах по отношению к контрольной группе и коэффициент регрессии.

Для вычисления объёма опухолевых очагов у каждого животного с помощью штангенциркуля проводили измерение двух максимальных взаимно перпендикулярных размеров (длина и ширина). Объём опухолевого очага вычисляли по модифицированной эллипсоидальной формуле 1 [12]:

v ^ ,                                        (1)

где L – длина, мм; W – ширина, мм.

Торможение роста опухоли (ТРО, %) вычисляли по формуле 2 [13]:

ТРО = ^Vk - ^VVo x 100% ,                                            (2)

vk где Vk – средний объём опухоли в контрольной группе на определённый срок измерения, мм3; Vo – средний объём опухоли в опытной группе на определённый срок измерения, мм3.

Так же был рассчитан коэффициент регрессии опухолевых очагов по формуле 3 [14].

V„-Vf

Регрессия =-----,                                                (3)

vu где Vu – средний исходный объём опухоли в группе до введения РФЛП, мм3; Vt – средний объём опухоли в группе на определённый срок измерения после введения РФЛП, мм3.

Статистический анализ

Данные, полученные при измерении объёма опухолевых очагов, были обработаны методами математической статистики с применением пакета прикладной программы Microsoft Excel с вычислением среднего арифметического (М) и стандартного отклонения (m). Для оценки достоверности различия средних значений показателей, характеризующих терапевтическую эффективность, использовали двухвыборочный t-критерий с различными дисперсиями. Различия между показателями считали статистически значимыми при p<0,05.

Информация о следовании принципам биоэтики

Все процедуры, связанные с проведением экспериментальных работ и умерщвлением животных, выполнены согласно правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных, методическими рекомендациями по эвтаназии лабораторных животных [15, 16], европейской конвенцией по защите лабораторных животных, изложенной в директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС) и руководстве по лабораторным животным [17, 18].

Результаты и обсуждение

Результаты анализа РФЛП

Результаты анализа РФЛП [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T, использованного в ходе данного исследования, показали, что выбранные параметры синтеза обеспечивают количественную радиохимическую конверсию радионуклида, и готовый препарат имеет радиохимическую чистоту ≥99% (рис. 2). На момент применения в препарате не были обнаружены примеси несвязанного [¹⁷⁷Lu]Lu(III), продуктов термолиза, радиолиза и других радиохимических примесей, что подтверждало его пригодность для дальнейших исследований in vivo .

Длина(мм)

Время (мин)

Рис. 2. Типичные радиохроматограммы РФЛП [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T, полученные методами ТСХ (Rf для [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T – 0,8-0,9; Rf для [¹⁷⁷Lu]Lu(III) – 0) и ВЭЖХ (Rt для [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T – 12,8-13,1 мин). Радиохимическая чистота ≥99%.

Результаты исследования терапевтического действия РФЛП

В группе ЭДmin отличие объёма опухолевых очагов по сравнению с контролем статистически значимо (р˂0,05) во все сроки наблюдения. Значение ТРО, соответствующее минимальному критерию эффективности (ТРО≥50%) было достигнуто только к 30 суткам после введения радиофармпрепарата. Однако, значения коэффициента регрессии опухолевых очагов у животных этой группы оставались отрицательными, что означает только замедление их роста, а не тенденцию к прогрессирующей регрессии.

В группе ЭДmax отличие объёма опухолевых очагов по сравнению с контролем, так же и в группе ЭДmin, статистически значимо (р˂0,05) во все сроки наблюдения. Торможение роста опухолей у животных этой группы было ожидаемо более интенсивным, со значениями ТРО, соответствующими умеренно выраженному терапевтическому эффекту по шкале количественных критериев ингибирующего эффекта. Значения коэффициента регрессии опухолевых очагов были положительными во все сроки наблюдения, однако с явной тенденцией к снижению (37,6 и 4,0 через 15 и 30 сут после введения РФЛП соответственно).

Срок исследования Группа ТРО Регрессия 15 сут после введения Контроль ЭДmin ЭДmax 33-,65 71,5 -117,1 -47,2 37,6 30 сут после введения Контроль ЭДmin ЭДmax 54,2 80,3 -391,8 -129,9 4,0 s s о о и о £ Е О

5 :ф ^ 10 О

■ Контроль

■ ЭДmin

■ ЭДmax

Время после введения, сут

Рис. 3. Динамика изменения объёма опухолевых очагов РПЖ 22RV1.

Таблица 2

В условиях данного эксперимента – однократного воздействия ЭД min [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T, т.е. активности, эквивалентной введению среднему человеку 2,0 ГБк РФЛП, на опухолевые очаги РПЖ 22RV1 недостаточно для получения даже умеренного терапевтического эффекта. При однократном воздействии ЭД max , т.е. активности, эквивалентной введению среднему человеку 8,0 ГБк РФЛП, наблюдается стойкий умеренный терапевтический эффект. Однако, анализ изменения значений коэффициента регрессии во времени позволяет с большой долей вероятности предположить, что спустя непродолжительное время после окончания срока наблюдения, рост опухолей у животных группы ЭД max возобновится, что косвенно подтверждают результаты исследований ТРО, опубликованные в 2021 г. исследователями из Мюнхенского технического университета. Эксперименты были выполнены на самцах мышей с тяжёлым комбинированным иммунодефицитом (SCID CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl) в возрасте не менее 6 недель. Продолжительность жизни контрольных животных с ксенографтами РПЖ человека линии C4-2 не превышала 30 дней, а в экспериментальной группе мышей, получивших 30 МБк ¹⁷⁷Lu-PSMA I&T, рост опухолевых очагов возобновлялся спустя 30-35 дней. Изученная авторами дозировка эквивалентна рекомендованной однократной дозе радиофармпрепарата для человека, равной 7,4 ГБк и близка к ЭД max , использованной в наших исследованиях [19]. При исходном объёме опухолевых очагов, равном 275,8±113,6 мм³, получен статистически значимый эффект торможения роста опухоли. Авторами также оценено увеличение продолжительности жизни животных, однако, этот показатель не применим к иммунодефицитным животным [9].

Оценка ожидаемых поглощённых доз в опухолевых очагах

Эффективный период полувыведения радиоактивности T eff из опухолевых очагов РПЖ 22RV1 составил 53,3-57,8 ч и не зависел от введённой активности [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA I&T. Поскольку ¹⁷⁷Lu является низкоэнергетическим β-эмиттером и с учётом значения R 90 , равного 0,63 мм, энергия, испускаемая радионуклидом, была практически полностью поглощена в опухолевых очагах. Таким образом, величина поглощённых доз внутреннего облучения опухолевых очагов РПЖ 22RV1 зависит только от введённой активности и биокинетики РФЛП в опухолевых очагах, а наблюдаемые в каждом диапазоне поглощённых доз терапевтические эффекты для экспериментальных опухолевых очагов РПЖ 22RV1 во многом определяются радиочувствительностью опухолевых клеток данной линии.

Рассчитанные значения ожидаемой удельной поглощённой дозы при минимальном и максимальном уровнях накопления РФЛП в опухолевых очагах (подкожных ксенографтах РПЖ человека линии 22RV1) представлены в табл. 3.

Таблица 3

Рассчитанные значения ожидаемой удельной поглощённой дозы в опухолевом очаге

Уровни накопления РФЛП в опухолевых очагах (экспериментальные данные)	В программе OLINDA/EXM 1.0	В программе IDAC_Dose 2.1
Минимальное Максимальное	257,8 мГр/МБк 392,7 мГр/МБк	280,6 мГр/МБк 427,5 мГр/МБк

При расчёте ожидаемых удельных поглощённых доз в опухолевых очагах в разных программах получены сопоставимые результаты, не имеющие значимых различий.

Заключение

При введении 9,2 МБк мышам с ксенографтами ПСМА-позитивного рака предстательной железы линии 22RV1 в опухолевых очагах формируются поглощённые дозы в диапазоне 2,7-3,9 Гр. В этом случае наблюдали статистически достоверное замедление роста опухолевых очагов без значимой регрессии в течение 30 суток наблюдения.

При введении 36,6 МБк мышам с ксенографтами ПСМА-позитивного рака предстательной железы линии 22RV1 в опухолевых очагах формируются поглощённые дозы в диапазоне 10,7-15,5 Гр. В этом случае, в течение первых двух недель исследования наблюдали статистически достоверное замедления роста опухолевых очагов, а также активную регрессию опухолевого роста.

Полученные результаты подтверждают информационную ценность доклинической оценки диапазона поглощённых доз в опухолевых очагах, вызывающих наблюдаемые терапевтические эффекты.

Публикация подготовлена по результатам доклинического исследования «Lu-PSMA 11 2021» (руководитель исследования О.Е. Клементьева, к.б.н.), одобренного протоколом ЛЭК ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России № 51 от 10.12.2021 г.