Exiguobacterium sp. RS34 - галоалкалотолерантная факультативно анаэробная неспорообразующая бактерия порядка Bacillales из шламохранилища калийного рудника

За последние годы таксономия и номенклатура грамположительных спорообразующих и аспорогенных бактерий порядка Bacillales (класс “BacillF, фи-лум Firmicutes) претерпели существенные изменения [Garrity, Bell, Lilburn, 2005; Ludwig, Klenk. 2005; Pruesse et al., 2007]. В третьем издании Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology в порядок Bacillales включено 12 семейств [Ludwig, Schleifer, Whitman, 2008]. По сравнению co вторым изданием определителя бактерий Берги [Garrity, Bell, Lilburn, 2005], в семействе Bacillaceae количество родов увеличено с 8 до 12. Однако аспорогенные палочковидные бактерии рода Exiguobacterium из-за неясного таксономического описания из семейства Bacillaceae выделены в отдельное семейство incertae sedis. Настоящая работа посвящена изучению штамма RS34, выделенного из шламохранилища калийного рудника, и описанию его в качестве вида рода Exiguobacterium.

Объекты и методы исследования

В июле 2008 г. изучали микрофлору шламохранилища СКРУ-3 ОАО “Уралкалий” (г. Соликамск, Пермский край). В техногенных водах шламохранилища, имеющего площадь около 5 га и максимальную глубину 10 м, от поверхности до дна понижалась температура, содержание растворенного кислорола и pH (от 9.5 до 6.4), повышалось количество бактериоподобных клеток по прямому счету (от 15 до 45 млн кл/мл) и общая минерализация (от 120 до 305 г/л). Растворенное органическое вещество в рассолы шламохранилища поступало в основном с водосборной площади и в составе технологических смесей гидрохлоридов (С8-С24)-мо-ноаминов, в результате деструкции которых содержание аммонийного азота в поверхностном слое водной толщи достигало 50 мг/л. Наше внимание было обращено на тот факт, что среди галотоле-рантных сапрофитов, выявляемых на разбавленном в 10 раз мясо-пептонном бульоне с 60 г/л NaCl, иногда доминировали грамположительные неспорообразующие короткие палочки с оранжевым пигментом. Методом последовательных пересевов сначала на жидких, затем на плотных средах

был получен и очищен изолят RS34. По первичным данным В LAST-анализа последовательностей нуклеотидов гена 16S рРНК, штамм RS34 имел высокий уровень сходства с рядом видов рода Exiguobacterium.

Для длительного хранения культур штамма RS34 (в пробирках на скошенном агаре под резиновыми пробками при 2-3°С) использовали сложную среду, обеспечивающую стабильный аэробный рост при pH 7.8-8.0 и 35-37°С (г/л): агар Difco - 20; NaCl - 30; MgSO4 7Н2О - 1; СаС12 -2Н2О -0.1; NaHCO3 - 0.5; К2НРО4 - 0.3; МН4С1 - 0.3; гидролизат казеина и триптон - по 3; дрожжевой экстракт - 1; сахароза - 2; микроэлементы по Пфеннигу - 1 мл/л.

Хемотаксономические и молекулярно-генетические исследования

Определения состава полярных липидов мембран и внутриклеточных жирных кислот, молекулярно-генетические анализы выполняли с применением недавно описанных нами методов при изучении галофильных изолятов из рассолов и пенных продуктов обогащения калийных минералов СКРУ-2 и СКРУ-3 [Саралов и др., 2012а, б]. Нуклеотидная последовательность гена 16 S рРНК Exiguobacterium sp. RS34 депонирована в международную базу данных GenBank под номером JQ966108.

Результаты и их обсуждение

Штамм RS34 представлен грамположительны-ми подвижными короткими палочками размером

1.0-1. Iх 1.2-1.5 мкм (в стационарной фазе). Размножается бинарным делением в одной плоскости, спор и покоящихся форм не образует. Галоалкало-толерантен: растет на питательных средах с содержанием NaCl от 0 до 14% (оптимум 1-6%) в пределах pH 5.5-10.0 (оптимум 7.5-8.5) при 15 45°С? (оптимум 35-37°С). Хемоорганотроф, аэроб и факультативный анаэроб, способен к гетерофермен-тативному сбраживанию глюкозы. Образует каталазу, оксидазная реакция отрицательная. Обладает анаэробным нитратным дыханием, восстанавливает нитраты до нитритов; особенно активна анаэробная нитратредукция на лактате (слабее на пирувате). В качестве источника азота использует аммоний, нитраты и глутамат. Молекулярный азот не фиксирует, ацетилен до этилена не восстанавливает. Чувствителен к новобиоцину (5 мкг на диск), хлорамфениколу (10 мкг), ципрофлоксацину (10 мкг), эритромицину (10 мкг). В качестве источников углерода и энергии использует аминокислоты и пептиды, ряд углеводов и карбоновых кислот (табл. 1). Наиболее быстро растет в аэробных условиях на комплексной среде, в которой одновременно присутствуют гидролизат казеина, триптон, дрожжевой экстракт, глюкоза или сахароза. При утилизации глюкозы продуцирует органические кислоты с подкислением среды до pH 5.5 (слабее на сахарозе). Гидролизует казеин, желатин и растворимый крахмал. Твин 80 не гидролизует. При аэробном росте на поверхности агаризован-ных комплексных сред при 35-37°С через 3 дня формирует оранжевые выпуклые, круглые колонии до 2-4 мм в диаметре. Пигменты не продуцирует в анаэробных условиях: концентрированная центрифугированием суспензия клеток имеет серый цвет.

Таблица 1

Дифференцирующие признаки Exiguobacterium sp. RS34 от трех типовых штаммов видов

Е. aurantiacum DSM 6208 (Collins et al., 1983), E. aestuarii DSM 16306 (Ют et al., 2005) и

E. acetylicum DSM 20416 (Friihling et al., 2002). Все виды грамположительны, спор не образуют, обладают подвижностью (перитрихи), на воздухе формируют выпуклые колонии оранжевого или оранжево-желтого цвета, продуцируют каталазу и кислоты из глюкозы, мальтозы и фруктозы

Характеристика	RS34	Е. aurantiacum	Е. aestuarii	Е. acetylicum
Диапазон (опитимум): рн	5.5-10.0 (7.5-8.5)	6.5-11.5 (8.5; 9.5)	5.0-10.5 (6.5-8.5)	нд
NaCl, %	0-14 (1-6)	нд	0-19(2^1)	нд
Температура, °C	15—45 (35-37)	7-43 (25-37)	10—47 (30-37)	7—43 (35)
Анаэробный рост	+	+	+	-
NO2" из NO3"	+	(+)	+	-
Ферментация глюкозы	(+)	+	(+)	-
Оксидаза	-	-	-	+
Гидролиз крахмала	+	+	-	+
Утилизация (аэробно): Галактоза	(+)	(+)	+	—
Глицерин	+	+	нд	-
Ацетат	(+)	—	—	(+)
Лактат	(+)	—	нд	нд
Продукция кислот (аэробно) из: Галактоза			+
Манноза	—	—	+	+
Рибоза	-	-	+	-

Основные полярные	PG, DPG,	PG, DPG,	PG, DPG, РЕ,	PG, DPG,
липиды мембран	РЕ, PI	РЕ, РЕ	PI, PS	РЕ, РЕ

Окончание табл. 1
Характеристика	RS34	Е. aurantiacum	Е. aestuarii	Е. acetylicum
Основные клеточные жирные кислоты (%)	С17:о (35.5) С13:о(24.9) С15:о (20.0) С1б:о(7.5) С1б:1 (6.4)	Спо (36.0) С13:о(31.О) С15:о(12.7) С16:0(8.4) С12:о(3.4)	Сп:о(35.4) Спо (27.1) С15:о(16.3) С16:0(18.4) С18:0(3.9)	С13:о(22.О) С15:о(21.8) С1б:1(20.9) С1б:о(14.3) С14:о(И.4)
Г+Ц в ДНК, мол. %	46.8	53.2-55.8	48.6	46.6
Сходство по гену 16S рРНК, %	100	99.2	98.8	94.3

Обозначения: “+” - тест положительный, “(+)” - слабое проявление признака, “-” - тест отрицательный, “нд” -нет данных, PG - фосфатидилглицерин, DPG - дифосфатилглицерин, РЕ - фосфатидилэтаноламин, PI - фосфатиди-линозит, PS - фосфатидилсерин, PL - неидентифицированный фосфолипид.

Полярные липиды мембран содержат фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин, фосфати-дил-этаноламин и фосфатидилинозит. Важной особенностью изолята RS34 является его способность адаптивно изменять состав клеточных жирных кислот (ЖК). При аэробном росте на поверхности агаризованной комплексной среды с 1% NaCl при 37°С клетки из оранжевых колоний содержат более 82% разветвленных ЖК с нечетным числом атомов углерода Спо, Св о и Сп о (табл. 2). Однако в жид

кой среде с 12% NaCl в статической культуре без принудительной аэрации (микроаэробные условия) непигментированные серые клетки содержат более 50% насыщенных и ненасыщенных ЖК с четным числом атомов углерода, включая Спо и Си п В зависимости от состава среды и условий культивирования, комплекс клеточных ЖК штамма RS34 может быть подобен ЖК или Е. aurantiacum, или Е. acetylicum [Friihling et al., 2002; Kira et al., 2005].

Таблица 2

Жирнокислотный состав (%) двух типовых штаммов видов Е. acetylicum и Е. aurantiacum [Ют et al., 2005] и Exiguobacterium sp. RS34 в комплексной среде с различным содержанием NaCl при 37°С

Жирная кислота	Е. acetylicum	Е. aurantiacum	RS34
			1 % NaCl	12% NaCl
Изо-Спо	0.6	3.4	1.6	0.5
Изо-Сцо	13.5	11.5	10.4	11.1
Антеизо-С\у0	8.5	19.5	14.5	9.4
С14;0	11.4	0.7	1.5	0.8
ЯЗО-С15:0	19.7	10.4	17.6	10.1
Антеизо-С15.о	2.1	2.3	2.4	2.2
0)6:1 1С	15.8	1.3	1.6	10.5
С16:1 СО5С	1.7	—	—	0.9
0)6:1 С07с	3.4	-	1.1	2.7
ИЗО-С16;0	—	4.0	3.7	10.3
016:0	14.3	4.4	3.8	14.2
С]7:1 С010с	1.5	1.8	0.8	3.7
Изо-Сп.о	1.9	28.7	27.4	9.4
Антеизо-Смв	—	8.3	8.1	3.6
018:1 СО9С	2.4	2.0	1.8	4.1
С18:0	0.8	1.3	2.1	4.3
С20:0	—	—	1.1	1.6
Сумма ЖК с нечетным числом атомов углерода	47.2	82.5	82.8	49.2

Примечание. Представлены ЖК, содержание которых более 0.5% от суммы ЖК.

Содержание Г+Ц в ДНК (по методу температурной денатурации) у RS34 составляет 46.8 мол. %, фактически равно таковому у Е. acetylicum (46.6 мол. %), но ниже значения у Е. aurantiacum (53-56 мол. %). Согласно результатам филогенетического анализа последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК, штамм RS34 наиболее близок к ас порогенным видам рода Exiguobacterium семейства incertae sedis порядка Bacillales, но уровень сходства варьирует в широком диапазоне от 99.7 до 93.8% (рисунок). Причем изолят RS34 имеет сравнительно низкий уровень сходства (93.894.9%) с пресноводными и умерено галотолерант-ными видами кластера Е. acetylicum - Е. soli, но высокий уровень сходства (97.4-99.7%) с галоал-калотолерантными видами периферического кластера Е. aurantiacum - Е. aestuarii. Наиболее высокий показатель сходства (99.7%) он имеет с валидно неописанным Е. homiense H1-R8, с типовым штаммом Е. mexicanum - 99.5%, Е. aurantiacum -99.2%, Е. aestuarii - 98.8%, но с Е. acetylicum -лишь 94.3%, Е. soli - 93.8%.

На родовом уровне галоалкалотолерантный аспорогенный штамм Exiguobacterium sp. RS34 наиболее близко примыкает к спорообразующим термофильным видам рода Geobacillus (89.6-90.1%) семейства ВасШасеае, но значительно удален (83.2-83.7%) от спорообразующих термоацидо- фильных видов рода Alicyclobacillus семейства “Alicyclobacillaceae” с Г+Ц в ДНК более 60 мол. %. По рибосомальному гену уровень сходства RS34 с фотоорганотрофной анаэробной грамполо-жительной бактерией Heliobacterium chlorum (класс "Clostridia". порядок Clostridiales, семейство " Heliohacteriaceae") не превышает 82.0%. Именно Н. chlorum могла быть наиболее вероятным предком для сравнительно молодых спорообразующих и аспорогенных аэробных микроорганизмов порядка Bacillales, в частности, для двух кластеров гетерогенной группы неспорообразующих видов рода Exiguobacterium [Gupta, Mukhtar, Singh, 1999].

Филогенетическое положение исследуемого штамма Exiguobacterium sp. RS34 среди представителей различных родов порядка Bacillales . Дерево построено по 1335 нуклеотидам гена 16S рРНК. Алгоритм выравнивания - “neighbor-joining”.

Цифрами показана статистическая достоверность ветвления на основании “bootstrap’’-анализа 1000

- Exiguobacterium sp. RS34 (JQ966108)

Exiguobacterium homiense H1- R8 (DQ351341)

[- Exiguobacterium aurantiacum DSM 6208^T (DQ019166)

64L Exiguobacterium mexicanum 8N (AM072764) г- Exiguobacterium marinum TF-80^T (AY594266)

0.02

Exiguobacterium aestuarii TF-16^T (AY594264)

■ Exiguobacterium panipatensis SM1 (EF519705)

₅₁ ' — Exiguobacterium taiwanense GI-1329 (DQ344522)

' Exiguobacterium profundum 10C^T (AY818050)

• ■ Exiguobacterium arabatum PTK BIOS 3 (JF758868)

gg г Exiguobacterium acetylicum DSM 20416 (DQ019167)

L Exiguobacterium indicum HHS 31^T (AJ846291)

• — ।---Exiguobacterium artemiae 9 AN^T (AM072763)

• 10                                           т

  • ¹    Exiguobacterium sibiricum 255-15 (CP001022)

gg — Exiguobacterium oxidotolerans T-2-2^T (AB105164)

p Exiguobacterium undae DSM 14481^T (DQ019165)

5бП I Exiguobacterium antarcticum DSM 14480^T (DQ019164) 9SH_ Exiguobacterium soli DVS3y^T (AY864633)

E ^cobacilius subterraneus 34^T (AF276306) Geobacillus jurassicus DS1^T (AY312404)

. _ Geobacillus stearothermophilus IFO12550⁷ (AB021196)

100 I---- Brevibacillus parabrevis IFO 12334¹ (D78463) L Brevibacillus brevis JCM 2503^T (D78457)

-----------Brevibacillus laterosporus 1AM 12465^т (X57307) Paenibacillus macerans IAM 12467^т (AB073196)

— Paenibacillus polymyxa IAM 13419^T (D16276)

-------------Bacillus saliphilus DSM 15402¹ (AJ493660)

।-------Bacillus vedderi DSM 9768^T (Z48306)

100 I--------- Bacillus clarkii DSM 8720 (X76444)

।-------------------Alicyclobacillus acidocaldarius DSM 446^т (X60742)

190 I------------- Alicyclobacillus acidoterrestris АТОС 49025¹ (AB042057)

--------------------------------Hellobacterium chlorum DSM 3682^т (M11212)

альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%). Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. В качестве “outgroup” использована последовательность 16S рДНК типового штамма Heliobacterium chlorum

Таким образом, согласно филогенетическому анализу исследуемый изолят из шламохранилища калийного рудника имеет не только высокий уровень сходства с галоалкалотолерантными видами кластера Е. aurantiacum - Е. aestuarii, но определенные физиологические и хемотаксономические отличия от родственных видов (табл. 1, 2). По совокупности фенотипических и генотипических признаков на данном этапе работ он определен как Exiguobacterium sp. RS34 (JQ966108).

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН № 22 «Молекулярная и клеточная биология», проект № 01200963684. Идентификация изолята RS34 на основе гена 168рДНК выполнена Б.Б. Кузнецовым (при поддержке Минобрнауки РФ в ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН, Москва).