Фагоцитарная реактивность нейтрофилов периферической крови у больных с инфекционными осложнениями эндопротезирования коленного сустава

¹Введение. В настоящее время эндопротезирование является высокоэффективным и современным методом лечения многих заболеваний опорно-двигательного аппарата и последствий травм крупных суставов. В связи с увеличением объема оперативных вмешательств по замене сустава нарастает и частота послеоперационных осложнений [1, 2]. Согласно сведениям современной литературы, причинами ревизионного эндопротезирования коленного сустава (КС) являются асептическое расшатывание компонентов эндопротеза, механические повреждения, несостоятельность капсульно-связочных структур, а также пе-рипротезная инфекция [1]. По данным отечественных авторов, риск возникновения последней после первичной артропластики КС достигает 3-4% [3]. Патогенез развития имплантат-ассоциированного воспаления связан с процессом формирования обособленных микробных биоценозов (биопленок) на имплантируемой конструкции. К особенностям бактериальных сообществ в области установки эндопротеза относится их невосприимчивость к действию гуморальных и клеточных механизмов иммунной защиты организма, устойчивость к антибактериальной терапии [5, 6]. Имплантат, находясь в достаточно агрессивной по отношению к нему среде, взаимодействует с клетками иммунной системы, что приводит к активации ряда биологически активных веществ. К иммунокомпетентным клеткам относят нейтрофилы, моноциты крови, макрофаги, которые составляют фагоцитарное звено иммунитета и участвуют в неспецифической защите от инфекции. Общепринято считать, что характерными признаками фагоцитоза являются приближение, поглощение, киллинг и переваривание объекта фагоцитоза. В литературе представлены работы авторов, посвященных исследованию фагоцитарных реакций нейтрофилов периферической крови при инфекционных осложнениях после эндопротезирования крупных суставов [7–9]. Однако до настоящего момента не были определены отдельные показатели реактивности активированных нейтрофилов у пациентов с им-плантат-ассоциированной инфекцией на этапе ревизионного эндопротезирования КС.

Цель — определить показатели фагоцитарной реактивности нейтрофилов периферической крови у больных с имплантат-ассоциированной инфекцией на этапе ревизионного эндопротезирования КС.

Материал и методы. В исследование включены 70 пациентов, которым в 2019–2020 гг. в НИИТОН СГМУ была проведена первичная артропластика КС. Основную группу составили 40 пациентов с им-плантат-ассоциированной инфекцией в возрасте от 43 до 76 лет, 2о женщин (50%) и 20 мужчин (5о%). В группу сравнения вошли 30 пациентов без признаков инфекционно-воспалительного процесса от 47

до 72 лет, 17 женщин (56,7%) и 13 мужчин (43,3%), в том числе пациенты с асептической нестабильностью компонентов эндопротеза КС. Пациентам обеих групп выполнено одномоментное ревизионное эндопротезирование КС. Больные, вошедшие в исследование, дали добровольное информированное согласие на участие, которое одобрено комитетом по этике (протокол исследования ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского» Минздрава России № 6 от 04.02.2018 г.). Для определения ФАН использовали методику количественного определения поглотительной и переваривающей способностей нейтрофилов по отношению к микробной тест-культуре Staphylococcus aureus [10]. Забор периферической крови в объеме 5 мл осуществляли из локтевой вены натощак до и через 5 и 14 суток после операции. В центрифужную пробирку с 0,25 мл 2%-го раствора цитрата натрия вносили 1 мл исследуемой венозной крови и добавляли 1 мл взвеси суточной агаровой микробной культуры, предварительно подогретой до температуры 37 ºС. Лейкоцитарно-микробную взвесь перемешивали встряхиванием и выдерживали в термостате при температуре 37 ºС в течение 5 и 30 мин. Далее пробирки охлаждали в холодной проточной воде и центрифугировали при 1500 об/мин 7 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а из осадка каждой пробирки готовили два тонких мазка на обезжиренных предметных стеклах. Препараты высушивали при комнатной температуре и окрашивали «Лейкодиф-200». В препарате подсчитывали количество нейтрофилов, вступивших в фагоцитоз, на 100 нейтрофилов крови (увеличение 10×100, микроскоп Revalation III). Рассчитывались следующие показатели ФАН:

— ФП — процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе от общего их количества (норма — 65-100%);

— ФЧ — среднее число микробов, поглощенных одним нейтрофилом, характеризует поглотительную способность нейтрофилов (норма — 6–14 у. е.); ФЧ5 — фагоцитарное число через 5 мин инкубации, ФЧ30 — фагоцитарное число через 30 мин инкубации;

— ИЗФ характеризует переваривающую функцию нейтрофилов (норма — ≥1), высчитывается по формуле ИЗФ = ФЧ5/ФЧ30;

— КАФ — абсолютное число фагоцитирующих нейтрофилов (норма — 1,35-6,4 (10 9 /л)), высчитывается по формуле КАФ = ФП/100хНф (10 9 /л).

Для оценки полученных результатов использовали версию AtteStat_32.exe программного продукта Microsoft Office. Учитывая, что полученные результаты не соответствовали нормальному распределению согласно критериям Колмогорова — Смирнова и Шапиро — Уилка, для статистической обработки вариационных рядов применяли методы непараметрической статистики (критерий Вилкоксона). Данные представлены в виде медианы (Me), 25%-х и 75%-х квартилей. Уровень статистической значимости принят р <0,05, что не противоречит требованиям, предъявляемым к медико-биологическим исследованиям.

Таблица 1

Количество лейкоцитов в периферической крови у пациентов основной группы и группы сравнения до и после ревизионного эндопротезирования коленного сустава

Клеточный состав периферической крови, 109/л	Группа
	основная, n =40			сравнения, n =30
	сроки наблюдения
	до хирургического вмешательства	через 5 суток после хирургического вмешательства	через 14 суток после хирургического вмешательства	до хирургического вмешательства	через 5 суток после хирургического вмешательства	через 14 суток после хирургического вмешательства
Лейкоциты Нейтрофилы	5,08 (4,98; 5,25) 3,50 (2,90; 3,58)	16,23 (14,08; 16,89) p <0,05 7,80 (6,50; 7,90) p <0,05	9,57 (8,73; 9,57) p <0,05 5,50 (5,30; 5,70) p <0,05	4,50 (3,90; 4,50) 2,75 (2,50; 2,90)	10,25 (9,17; 10,25) p <0,05 3,85 (3,40; 4,60) p <0,05	6,44 (5,68; 8,17) p <0,05 3,55 (3,10; 3,90) p <0,05

Примечание: p <0,05 — относительно показателей, зарегистрированных до проведения хирургического вмешательства. Данные представлены в виде медианы (Me), 25%-х и 75%-х квартилей.

Таблица 2

Динамика показателей фагоцитарной активности нейтрофилов у пациентов основной группы до и после ревизионного эндопротезирования коленного сустава

Сроки наблюдения	Показатели
	фагоцитарный показатель (%)	фагоцитарное число (5 мин), (у. е.)	фагоцитарное число (30 мин), (у. е.)	индекс завершенности фагоцитоза	количество активных фагоцитов (109/л)
До хирургического вмешательства	74,0 (68,0; 76,0)	6,6 (6,1; 7,1)	10,4 (8,9; 12,1)	0,62 (0,49; 0,71)	2,42 (2,11; 2,45)
На 5-е сутки после хирургического вмешательства	93,0 (90,0; 96,0) р <0,05	15,1 (11,6; 15,6) р <0,05	15,9 (14,4; 16,5) р <0,05	0,89 (0,73; 0,92) р <0,05	7,33 (6,19; 7,38) р <0,05
На 14-е сутки после хирургического вмешательства	87,0 (84,0; 88,0) р <0,05 р <0,05	19,1 (17,6; 20,1) р <0,05 р <0,05	17,6 (16,9; 18,6) р <0,05	1,1 (0,98; 1,18) р <0,05 р <0,05	4,9 (4,52; 5,04) р <0,05 р <0,05

Примечание: p — показатель значимости различий относительно значений до операции; р ₁— относительно значений через пять суток после операции. Данные представлены в виде медианы (Me), 25%-х и 75%-х квартилей.

Результаты. Анализ полученных данных показал, что у пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией в период подготовки к ревизионному эндопротезированию КС общее количество лейкоцитов в периферической крови составило 5,08х10⁹/л, а абсолютное количество нейтрофилов — 3,50х10⁹/л.

Через пять суток после реимплантации КС общее количество лейкоцитов в периферической крови было 16,23х109/л, а абсолютное содержание нейтрофильных лейкоцитов — 7,8х109/л, что было значимо выше исходного количества. К 14-м суткам наблюдения зафиксировано общее содержание лейкоцитов 9,57х109/л, а абсолютное содержание нейтрофилов — 5,50х109/л, что также выше значений, имевшихся у пациентов до проведения операции (табл. 1). У пациентов группы сравнения до операции общее содержание лейкоцитов составило 4,50х109/л, абсолютное количество нейтрофилов — 2,75х109/л. Через пять суток после хирургического вмешательства общее содержание лейкоцитов было 10,25х109/л, а абсолютное содержание нейтрофилов — 3,85х109/л, что превышало значения данных показателей в дооперационный период. На 14-е сутки после операции общее содержание лейкоцитов в периферическом кровотоке соответствовало 6,44х109/л, а абсолютное содержание нейтрофи- лов — 3,55х109/л, что также статистически достоверно выше значений, полученных до ревизионной установки эндопротеза коленного сустава.

У пациентов основной группы исследуемые показатели фагоцитарной активности до ревизионного эндопротезирования КС составили: ФП — 74,0%, ФЧ5–6,6 у. е., ФЧ30–10,4 у. е., ИЗФ — 0,62, КАФ — 2,42х10⁹/л. На 5-е сутки после операции на фоне лейкоцитоза, преимущественно нейтрофильного, по отношению к дооперационным значениям обнаружено повышение ФП в среднем в 1,26 раза ( р <0,05) и КАФ — в 3,02 раза ( р <0,05). Кроме того, возрастала поглотительная функция нейтрофилов: увеличение ФЧ5 в 2,29 раза ( р <0,05), ФЧ30 в 1,52 раза ( р <0,05), а также переваривающая функция нейтрофилов — увеличение ИЗФ в 1,43 раза ( р <0,05). Через 14 суток после ревизии эндопротеза КС по отношению к предыдущему сроку наблюдения уменьшались ФП в 1,07 раз ( р ₁<0,05), КАФ в 1,50 раз ( р ₁<0,05) на фоне более выраженного увеличения поглотительной функции — увеличение ФЧ5 в 1,26 раза ( р ₁<0,05) — и переваривающей функции нейтрофилов — увеличение ИЗФ в 1,24 раза ( р ₁<0,05). Полученные значения ФАН периферической крови оставались достоверно выше значений, полученных до операции ( р <0,05) (табл. 2.).

Таблица 3

Динамика показателей фагоцитарной активности нейтрофилов у пациентов группы сравнения до и после ревизионного эндопротезирования коленного сустава

Сроки наблюдения	Показатели
	Фагоцитарный показатель (%)	Фагоцитарное число (5 мин.), (у. е.)	Фагоцитарное число (30 мин.), (у. е.)	Индекс завершенности фагоцитоза	Количество активных фагоцитов (109/л)
До хирургического вмешательства	71,0 (68,0; 75,0)	7,4 (6,3; 8,1)	9,49 (7,9; 10,02)	0,77 (0,69; 0,81)	2,06 (1,72; 2,14)
На 5-е сутки после хирургического вмешательства	77,0 (76,0; 78,0) р <0,05	8,6 (7,1; 9,2) p <0,05	10,4 (8,9; 12,1)	0,76 (0,68; 0,88)	2,92 (2,81; 3,49) р <0,05
На 14-е сутки после хирургического вмешательства	81,0 (77,0; 84,0) р <0,05	9,4 (8,9; 11,1) р <0,05	11,9 (9,3; 12,2) р <0,05 р <0,05	0,82 (0,78; 0,91) p >0,05	2,72 (2,59; 3,21) р <0,05

Примечание: p — показатель значимости различий относительно значений до операции; р ₁ — относительно значений через пять суток после операции. Данные представлены в виде медианы (Me), 25%-х и 75%-х квартилей.

У пациентов без признаков инфекционно-воспалительного процесса показатели ФАН в доопераци-онном периоде характеризовались следующими значениями: ФП — 71,0%, ФЧ5-7,4 у. е., ФЧ30-9,49 у. е., ИЗФ — 0,77, КАФ — 2,06х109/л (табл. 3).

На 5-е сутки наблюдения по сравнению с до-операционным сроком зафиксировано статистически значимое увеличение ФП в 1,08 раза ( р <0,05), КАФ — в 1,42 раза ( р <0,05), а также ФЧ5 в 1,1 раза ( р <0,05), не зафиксировано достоверных различий ФЧ30 ( р >0,05), ИЗФ ( р >0,05) по сравнению с исходными показателями. Через 14 суток после хирургического вмешательства по отношению к предыдущему периоду наблюдения отмечали тенденцию к увеличению ФП ( р ₁>0,05), ФЧ5 ( р ₁>0,05), ИЗФ ( р ₁>0,05) и к снижению КАФ ( р ₁>0,05), значимое повышение ФЧ30 в 1,14 раза ( р ₁<0,05). Полученные цифры были статистически значимо выше данных, полученных в до-операционный период ( р <0,05), кроме ИЗФ ( р >0,05).

Обсуждение. Известно, что реакция организма на реимплантацию эндопротеза КС связана с развитием иммунологического дисбаланса в ответ на установку инородного тела. Не вызывает сомнений, что нейтрофилы — одни из основных участников фагоцитоза; благодаря наличию рецепторов к значительному числу эндогенных медиаторов они реагируют на малейшие изменения постоянства внутренней среды [11]. У пациентов основной группы на 5-е сутки после ревизионного эндопротезирования КС увеличение количества активных фагоцитов, а также поглотительной и переваривающей способностей нейтрофилов периферической крови, вероятно, связано не только с изменением привычного гомеостатического равновесия, возникшего в результате оперативного вмешательства, но и с наличием микрофлоры в околопротезной зоне. Через 14 суток после операции уменьшение количества активных фагоцитов на фоне более выраженного увеличения поглотительной и переваривающей активности нейтрофилов периферической крови указывают на напряженность защитных и адаптационных возможностей организма у пациентов с имплантат-ас-социированной инфекцией, что косвенно совпадает с мнением ряда отечественных авторов [12].

Опираясь на значения показателей ФАН периферической крови у больных группы сравнения, полученных через 5, 14 суток после реэндопротезирования КС, мы предполагаем, что активация неспецифических иммунных механизмов обусловлена взаимодействием имплантата и окружающих его ткани. Приток фагоцитарных клеток (нейтрофилов) в зону имплантации также обеспечивает инактивацию патогенов, к которым относятся частицы износа составных компонентов эндопротеза.

Заключение. У пациентов основной группы через пять дней после ревизионного эндопротезирования КС зафиксировано повышение ФП и КАФ на фоне увеличения поглотительной и переваривающей функций нейтрофилов периферической крови. Через 14 дней после операции по сравнению с предыдущим сроком наблюдения отмечали снижение ФП, а также КАФ на фоне более выраженного увеличения поглотительной и переваривающей функций нейтрофилов периферической крови. У пациентов группы сравнения через 5 и 14 дней после операции зафиксировано увеличение поглотительной функции нейтрофилов периферической крови.