Факторы персистенции стафилококков, изолированных от бактерионосителей

Романова, Гинцбург, 2004; Гостев, Сидоренко, 2010; Аrcher et al., 2011].

Штаммы S. aureus обладают генами, кодирующими О-ацетилтрансферазу пептидогликана – фермента, обеспечивающего модификацию пептидогликана клеточной стенки, в результате чего формируется устойчивость к действию лизоцима [Бухарин, 2014]. Штаммы коагулазоотрицательных стафилококков (КОС) способны продуцировать различные вещества, обладающие антилизоцимными свойствами. Однако степень выраженности устойчивости к лизоциму у различных изолятов остается вариабельным признаком.

По данным различных авторов, до 60% всех бактериальных инфекций человека связаны с образованием биопленок [Гостев, Сидоренко, 2010]. Под биопленками принято понимать живое, постоянно обновляющееся сообщество одного или нескольких видов бактерий, которые закрепились на биогенном или абиогенном субстрате и окружены полимерным материалом (матриксом), предохраняющим их от вредных воздействий окружающей среды [Чеботарь, 2012; Поспелова, Горовиц, Лемкина, 2014]. Формирование биопленок в очаге воспаления ведет к хрони-зации инфекционного процесса и сопровождается неудовлетворительными результатами антибиотикоте-рапии [Gotz, 2002; Kaplan, 2010].

На процесс биопленкообразования могут оказывать влияние многочисленные факторы иммунной системы, в том числе лизоцим. В соответствии с данными литературы существуют различные точки зрения в отношении его влияния как одного из факторов гуморального врожденного иммунитета на биоплен-кообразование стафилококков [Аrcher et al., 2011]. По данным [Чеботарь, 2012], лизоцим усиливает как адгезию S. aureus – первый этап биопленкообразования, так и второй – индуцирует их агрегацию. Напротив, [Yuan, Wan, Liang, 2011] считают, что лизоцим угнетает адгезию стафилококков, тем самым снижая уровень биопленкообразования.

Цель исследования – оценить устойчивость к лизоциму и биопленкообразующую способность выделенных от практически здоровых людей культур стафилококков, а также взаимосвязь изученных факторов персистенции.

Материалы и методы

На стафилококковое бактерионосительство обследовано 92 практически здоровых человека. Материал забирали стерильными ватными тампонами со слизистых носа и зева. Посев исследуемого материала проводили параллельно на желточно-солевой и кровяной агары. Способность стафилококков коагулировать плазму изучали традиционным методом с использованием цитратной кроличьей плазмы.

Биопленкообразующую способность стафилококков исследовали в 96-луночных полистироловых планшетах для иммуноферментного анализа (Медпо-лимер, Россия). В 6 лунок каждого ряда планшета вносили по 100 мкл инокулума определенного штамма стафилококков, содержащего 107 КОЕ/мл, после чего планшеты инкубировали в течение 24 ч в термостате (37°С). Через сутки планктонную культуру из всех лунок удаляли, биопленки дважды промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7.2), затем окрашивали 0.1%-ным раствором генцианвиолета, с последующей спиртовой экстракцией связавшегося красителя для оценки общей биомассы образовавшихся пленок. Детекцию окрашенных экстрактов биопленок осуществляли на ридере BenchmarkPlus (BioRad, США) при длине волны 570 нм. Степень выраженности биопленкообразования стафилококков определяли в соответствии с критериями, разработанными [Stepanovic et al., 2007].

Для изучения влияния лизоцима на биопленкооб-разование изолированных штаммов стафилококков в 4 лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносили по 100 мкл бульона LB с лизоцимом в концентрации 10.0 мкг/мл, затем добавляли по 25 мкл исследуемой культуры стафилококков (107 КОЕ/мл). Контроль – 100 мкл бульона LB без лизоцима и 25 мкл этой же культуры стафилококков (2 лунки). Планшеты инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С. Через сутки лунки планшета дважды промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7.2), окрашивали 0.1%-ным раствором генцианвиолета с последующей спиртовой экстракцией связавшегося красителя для оценки общей биомассы образовавшихся пленок. Далее измеряли оптическую плотность на ридере при длине волны 600 нм и рассчитывали средние значения оптической плотности в опытных и контрольных лунках. Оценку влияния лизоцима на биопленкообразование штаммов стафилококков выполняли по разнице цифровых значений оптической плотности в опыте и контроле. Устойчивость изолятов к лизоциму изучали оригинальным методом (патент № 2567642). В 4 лунки 96- луночного полистиролового планшета для иммуно-ферментного анализа (Медполимер, Россия) вносили по 100 мкл бульона LB с лизоцимом в концентрации 12.5 мкг/мл, затем добавляли по 25 мкл исследуемой культуры стафилококков (107 КОЕ/мл), культивируемой в условиях постоянного встряхивания. В 2 контрольные лунки добавляли 100 мкл бульона LB без лизоцима и 25 мкл культуры. Планшеты инкубировали при температуре 37°С. Через 2 и 4 ч инкубации измеряли оптическую плотность смесей (опыт и контроль) на ридере BenchmarkPlus (BioRad, США) при длине волны 600 нм. Далее рассчитывали коэффициент устойчивости к лизоциму по формуле

К=

V_К×V Л ×C Л × (М О ₄ - М О ₂)

М К4 - М К2

×100,

где К – коэффициент устойчивости стафилококков к лизоциму; V К – объем бульонной культуры исследуемого штамма; V Л – объем раствора лизоцима исходной концентрации; C Л – концентрация лизоцима; М О4, М О2 – среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 4 и 2 ч инкубации; М К4, М К2 – среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 4 и 2 ч инкубации.

Значение К<0.49 определяли как низкую степень выраженности признака, К в пределах 0.5– 2.49 – как среднюю степень, а К>2.5 – как высокую степень выраженности.

Результаты и их обсуждение

Всего со слизистых носа и зева практически здоровых людей выделено 113 штаммов стафилококков, из них S. aureus – 27, КОС – 86.

Все культуры стафилококков обладали устойчивостью к лизоциму той или иной степени выраженности, данные представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты изучения степени выраженности устойчивости к лизоциму S. aureus и КОС

Виды стафилококков	Количество штаммов (абс/%) с различной степенью устойчивости к лизоциму
	низкая	средняя	высокая
S. aureus	1/	6/	20/
( п =27)	3.7±0.7	22.2±4.3	74.1±14.3
КОС	43/	28/	15/
( п =86)	50.0±5.4	32.6±3.7	17.4±1.9
р	0.0001	0.32	0.0001

Примечание. р – статистическая значимость различий степени выраженности устойчивости к лизоциму между штаммами S. aureus и КОС (расчет для абсолютных показателей).

Из представленных в таблице данных следует, что изоляты S. aureus и КОС отличались между собой по степени выраженности данного признака (различия статистически значимы). Так, штаммы S. aureus чаще обладали высокой степенью резистентности к лизоциму. Напротив, у культур КОС чаще регистрировали низкую степень выраженности этого признака. Что касается средней степени, то она в большей мере была характерна для изоля-тов КОС, но статистически значимых различий не выявлено. Таким образом, культуры S. aureus отличались более выраженной устойчивостью к действию лизоцима.

В последующем проведено изучение биоплен-кообразования (БПО) изолятов. Результаты представлены в табл. 2.

Из представленных в табл. 2 данных следует, что практически половина тестируемых культур характеризовались высокой степенью выраженности БПО. При этом штаммы КОС чаще обладали слабой степенью выраженности БПО в сравнении с культурами S. aureus (различия статистически значимые). Для средней и сильной степени таких закономерностей не выявлено.

Таблица 2

Результаты изучения степени выраженности биопленкообразования S. aureus и КОС

Виды стафилококков	Количество штаммов (абс/%) с различной степенью выраженности БПО
	слабая	средняя	сильная
S. aureus	1/	12/	14/
( п =27)	5.9±1.4	44.4±11.4	54.9±20.0
КОС	20	26/	40/
( п =86)	23.4±2.9	30.2±3.7	46.5±5.7
р	0.0001	0.12	0.43

Примечание. р – статистическая значимость различий степени выраженности биопленкообразования между штаммами S. aureus и КОС (расчет для абсолютных показателей).

Проведен анализ взаимозависимости изученных факторов персистенции стафилококков – степени выраженности устойчивости к лизоциму и интенсивности биопленкообразования. Для всех изученных штаммов стафилококков, независимо от способности коагулировать плазму, степень проявления устойчивости к действию лизоцима и интенсивность БПО находятся в обратной зависимости ( r = –0.35). Иными словами, у штаммов с высокой степенью резистентности к лизоциму, как правило, регистрировали низкую степень выраженности биопленкообразования. Учитывая однонаправленность этих факторов, можно полагать, что они «компенсируют» друг друга.

В серии специальных экспериментов изучено влияние лизоцима на биопленкообразование изолированных штаммов стафилококков. Установлено, что в присутствии лизоцима биопленки, образованные различными видами стафилококков, были менее выражены, в сравнении с контролем. Так, среднее значение оптической плотности толщины биопленки в лунках с лизоцимом составило 0.486±0.046, в контроле – 0.792±0.074 (р=0.00007). Данный факт показал значение лизоцима, как фактора, снижающего БПО, при воздействии непосредственно на стафилококки.

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что все изученные штаммы стафилококков характеризуются устойчивостью к лизоциму и способностью образовывать биопленки различной степени выраженности. Кроме того, выявлена обратная корреляционная связь между изученными факторами персистенции. Показано также значение лизоцима как фактора, снижающего биоплен-кообразование стафилококков.

Выражаем глубокую признательность Лемкиной Ларисе Марковне, старшему научному сотруднику лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, за проведение исследований.