Факультативно-анаэробные и аэробные бактерии - деструкторы органического вещества, выделенные из донных отложений содово-соленых озер Забайкалья и Монголии

* Работа выполнена при поддержке грантов Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы», Президиума СО РАН № 24, УрО и СО РАН «Микробные сообщества кстремальных экосистем» и Минобразования науки РНП. 2,1.1.4566,

Исследуемые озера Забайкалья и Монголии представая ют собой интерес в связи с наличием большого разнообразия микроорганизмов, относящихся к различным функциональным группам, среди которых важное место занимают гидролитические бактерии. В донных отложениях содовых озер аэробные и анаэробные бактерии осуществляют гидролиз высокомолекулярных биологических полимеров - белков, жиров, углеводов, целлюлозы, деструкцию летучих жирных кислот.

Целью данной работы было выделение и изучение представителей основных функциональных групп бактерий-деструкторов органического вещества.

Методы

Выделение культур аэробных органотрофных бактерий проводили на минеральной среде, описанной ранее (Митыпова и др., 2005) с добавлением пептона, дрожжевого экстракта (ДЭ) и глюкозы в суммарной концентрации 5% и на РПА. Значения pH и солености в средах культивирования устанавливали соотношениями NaHCO.i, Na 2СО3 и NaCI в соответствии с гидрохимией озер.

Выделение чистых культур включало три этапа: 1) получение накопительной культуры; 2) выделение чистой культуры из изолированных колоний на агаризованной среде; 3) очистка культуры от сопутствующих организмов путем многократного пересева с жидкой на агаризо-ванную среду с последующим выделением колоний. Чистоту культуры контролировали микроскопированием и по однородности колоний.Чистые культуры поддерживались на минеральной среде с дрожжевым экстрактом (ДЭ) (5г/л).

Морфотипы бактерий, размеры, подвижность и спорообразование изучали микроскопированием образцов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus (Karl Zeiss) в фазовом контрасте и на окрашенных препаратах при 100-кратном увеличении объектива (общее увеличение 1000).

Эколого-физиологические, биохимические характеристики и ферментативную активность выделенных изолятов исследовали по стандартным методикам (Методы общей бактериологии, 1984)

Спорообразование у бактерий выявляли: 1) прогреванием до 80°С в течение 10 минут, и последующим посевом на питательную среду; 2) окрашиванием спор по методике Пешкова; 3) фотографированием старых культур.

Состав оснований ДНК определен на основании анализа кривых плавления ДНК в Институте микробиологии им. Виноградского РАН (г. Москва) Секвенирование генов I6S-PHK проведено в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино) и Лимнологическом институте СО РАН (г. Иркутск).

Результаты

Из донных отложений и микробных матов содово-соленых озер Забайкалья и Монголии аэробно были выделены 50 культур бактерий-деструкторов органического вещества (ОВ). Детальные исследования были проведены с 32 изолятами. Отбор производился с учетом доминирующего роста и эколого-физиологических особенностей штаммов. В выборку было включено: 18 изолятов из оз. Соленое, 3 - Алгннское, 2 - Нухэ-Нур, 2 - Безымянное, 4 - Долон Давст Ну-ур и 3 - Хилганта.

Морфологическая характеристика культу. На агаризованных средах изоляты образовывали круглые, реже концентрические или амебовидные колонии от неокрашенных до пигментированных: светло-желтых, желтых, оранжевых и ярко-красных. Размеры колоний варьировали от 1 до 5-6 мм, за исключением штаммов Д4 и ХЗ, образующих колоний диаметром 12 и 17 мм, соответственно.

Края колоний в основном ровные, но у некоторых ветвистые и слегка волнистые. Профиль колоний изолятов выпуклый, или каплевидный и плоский, встречаются колонии вросшие в агар.

Клетки 18 изолятов представлены палочками, размеры которых варьируют в пределах от 0.29-0.43 х 1.43-1.7 мкм до 0.71-0.86 х 2.43-3.14 мкм; 4 - овальными клетками (0.71-1.14 х 1.141.86 мкм) и одного изолята (Л1К) - изогнутыми палочками 0.57 х 2.57-5 мкм. Клетки 9 изолятов являлись кокками диаметром от 0.76 до 1.29 мкм. У 12 культур выявлено спорообразование. Размеры спор составляют от 0.57 х 0.86 мкм до 0.86 х 1.14 мкм (рис.1).

Эколого-физиологическая .характеристика культур

По отношению к pH среды все органотрофы являются факультативными алкалофилами, среди сапрофитов преобладали алкалотолерантные бактерии (табл. 1).

Выделенные культуры росли на среде без NaCI, однако большинство культур хорошо росло при содержании NaCI от 5 и до 100 г/л, что позволяет отнести выделенные культуры к галото- лерантным. У некоторых изолятов наблюдался рост при концентрации NaCI до 200 г/л. В основном оптимум роста культур находился в пределах NaCI 15-75 г/л. По отношению к температуре выделенные микроорганизмы являлись мезофилами с оптимальным ростом в пределах 25-40°С, за исключением культуры А1, рост которой был отмечен до 55°С, проявляя термотолерантные свойства. Выделенные культуры по отношению к кислороду являются факультативно-анаэробными бактериями, за исключением строго аэробных культур Ski и Nu.

Н.о. - не определено

Рис. 1. Фотографии культур: а) Д2; б) ЦЗ; в) Sk 1; г) К5; д) 10а; е) 17п; ж) 34; з) и) Л1 К: к) Кб; л) Nu; м) Д1; н)

С4К линейка 5 мкм

Эколого-физиологические свойства культур

Таблица 1

Культура	Пределы pH	Оптимум pH	Пределы NaCI,г/л	Оптимум NaCI,г/л	КОНтест	М орфотип клеток	Размеры клеток, мкм
AI	8.6-10	9	0-100	0	+	Палочки	0,29 х 1,57-2,7 спора = 0,57
АЗ	6,5-11	9-10	0-200	75		овальные палочки	0,86-1 х 1Л4-1,7 споровые
А4	8-11	9,5	0-200	30-100	+	Палочки	0,71-0,86x2,43
Д1	6-10	8	0-100	30	+	Палочки	0,43 х 2,14
Д2	5,5-10,5	8	0-140	30-50	—	Палочки	0,71 х3>3,5 споровые
ДЗ	7-9,5	8,8	0-75	30	-	Палочки	0,43 х 1,86-2 спора = 0,57 х 0,86
Д4	7-9,5	8,8	5-180	50	-	Палочки	0,57 х 1,7-2,85 споровые
К1	7,5-10	8,7	5-180	75-100	-	Палочки	0,43 к 1,14-1,43
КЗ	6,5-10,5	8.8	0-200	50	-	Кокки	d= 1,29
К4	7,5-10	8,8	0-180	100		Палочки	0,43 х 1,43-1,7
К5	6,5-11,5	10	0-200	30-75	-	Кокки	d = 1-1,14
Кб	5,8-11	8,5	0-200	75-100	+	овальные палочки	0,71-0,86 х 1,43-1,86
К7	7,5-11	9,5	0-180	30	+	Кокки	d= 1
К8	6,5-11	9	0-200	50-75	+	Кокки	d =0,76- 0,86
XI	7-9,5	8,7	0-100	5-50(15)	—	Палочки	0,43 x 1,7 споровые
ХЗ	7-11	8,5-9,5	0-100	30	—	Палочки	0,43 x 1,43-2 J 4 споровые
Х4	7,5-10	9	0-100	100		Кокки	d = 0,86
17п	7-10,5	8,8	0-100	75	+	овальные палочки	0,86-1,14 x 1,86-3.43
2а	7,5-10,5	9,2	0-160	50-75		Палочки	0,57x2,71 спора = 0,71x1

8а	7-10	9,3	0-100	15-50		овальные палочки	М4х Ц57-1.86 споровые
10а	6-10,5	9,3	6-100	15-50		Палочки	0,71 х 2,43 спора = 0,86 х 1,14
С1К	7,5-10,5	8,6	Г 0-100	30-50	-	Палочки	0,71 х2,85
С2К	6,5-9,5	7,5	0-200	30		Кокки	4=1
С4К	6-10	8-8,5	0-200	15	-	Кокки	d = 0,76-0,86
32	7,5-11	9,5-10	6-200	15-30	+	Кокки	d = 0,86-1
34	7-10	8,5-9	0-100	50	4-	Палочки	0,57-3,6 спора = 1x1,14
SKI	6,5-11	7,7	0-75	30	+	Палочки	0,29-0,43 х 1,71-3,86
N2	6-10	8,5-9	0-100	0-50	-	Кокки	d=0,7
Nu	6,5-10	7.6	0-7,5	0,5-1,5	+	Палочки	0,4 0,5 х 1,1-1,7

Биохимическая характеристика культур. Культуры обладали широкой метаболической активностью и росли на всех протестированных субстратах: крахмале, пептоне, твине, ацетате, лактате, аминокислотах (аспарагине, цистеине и глутаминовой кислоте). Все культуры хорошо росли на среде с ДЭ в качестве единственного источника углерода и энергии, почти все изоляты росли на среде с пептоном, кроме одной - А1. 17 выделенных культур проявляли способность к фиксации молекулярного азота.

Сероводород из белок-содержащих субстратов образует только 11 культур. Изоляты используют для роста арабинозу, рамнозу, рафинозу, маннит, фруктозу, глюкозу, инозит, лактозу, сорбит и дульцит, слабый рост отмечен на ксилозе, сахарозе, маннозе, инозите. У всех культур рост отсутствовал на галактозе. Большинство изолятов газ и кислоту из сахаров не образуют, но у некоторых культур наблюдалось кислотообразование из протестированных углеводов.

Ферментативная активность культур. Определена ферментативная активность у выделенных культур. 18 изолятов проявили амилолитические свойства. Колонии амилолитических бактерий в диаметре составляют 1.5 - 4.0 мм. При этом минимальные зоны гидролиза крахмала составляют 1-2 мм; средние зоны - 4-5 мм и максимальную зону просветления проявил изолят 34-7 мм. Соотношения диаметра колонии к диаметру зоны гидролиза варьируют от 0,1 до 0,43. Казеиназной активностью обладают только 5 изолятов, хотя на среде с пептоном отмечен рост у всех изолятов, кроме изолята А1. Разжижать желатину способны только 5 культур. 6 изолятов проявили липазную активность с зоной гидролиза Твина 80 от 5 до 14 мм. Эндоцел-люлазной активностью обладают 3 изолята: Д2, XI и ХЗ. Каталазная активность выявлена у 21 изолята; оксидазная активность у 19. Генотипическая характеристика культур. Для 12 изолятов было определено процентное содержание ГЦ (гуанин+цитозин) в ДНК. Изоляты кластиро-вались в 3 группы по низкому, среднему и высокому содержанию ГЦ в ДНК. Низкий уровень ГЦ отмечен у изолятов Ski и XI (29,8 и 31,5 мол. % соответственно). Высокое содержание ГЦ отмечено у двух изолятов - Х4 (50,4 мол. %) и С2К (70,4 мол. %), Промежуточное положение занимали культуры с содержанием ГЦ в пределах от 36,1 до 44,4 мол. % (С4К, ДЗ, 34, КЗ, К4, ЦЗ,С1К, Nu).

Неполный сиквенс гена 16S рРНК у 6 изолятов для 4 показал сходство на уровне 98-100% с валидно описанными видами: 100 % сходство между штаммом К5 и Bacillus saliphilus, 99% сходства изолята 17п с Halomonas desiderata, 99 % сходства изолята Кб с Halomonas axialensis, и 98 % сходства изолята Д1 с Oceanbacillus iheyensis. Изоляты Nu и Ski показали сходство с близкородственными последовательностями на уровне 89 % (Hongiella mannitolivorans) и 92% (Algoriphagus sp.10.1), что позволяет отнести их к новым родам семейства Flexibactericeae, к группе Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides.

Таким образом, выделенные культуры микроорганизмов являются алкало- и галотолерант- нымн факультативно-анаэробными бактериями-деструкторами органического вещества, активно функционирующими в микробном сообществе содово-соленых озер Забайкалья и Монголии. Культуры, определенные с помощью молекулярно-генетических методов оказались как близкородственными с ранее известными обитателями экстремальных экосистем, так и представителями новых родов и видов.