Фармакокинетика 68Ga-NODA-аминоглюкозы в организме мышей с карциномой Эрлиха

Неуклонный рост числа онкологических заболеваний в России и мире диктует необходимость поиска новых путей диагностики и терапии рака [1]. На сегодняшний день позитронная эмиссионная томография (ПЭТ) считается наиболее информативным методом ядерной медицины, позволяющим выявлять метаболические нарушения в организме на молекулярном уровне до появления структурных изменений. ПЭТ обладает более высокой чувствительностью, более высоким пространственным разрешением, улучшенными возможностями количественной оценки исследуемых процессов и низкой радиационной нагрузкой на пациента по сравнению с другими диагностическими методами.

Широкое распространение метода ПЭТ во многом определяется используемыми радиофармацевтическими лекарственными препаратами (РФЛП). На сегодняшний день основным диагностическим РФЛП для ПЭТ остается [18F]фтор-2-деокси-2-D-глюкоза (18F-ФДГ). Его использование позволяет не только выявлять опухоли различных локализаций, но и проводить

Тищенко В.К. – вед. научн. сотр., к.б.н.; Петриев В.М.* – зав. лаб., д.б.н., проф. НИЯУ МИФИ; Михайловская А.А. – ст. науч. сотр., к.б.н.; Фёдорова А.В. – вед. инженер; Степченкова Е.Д. – мл. научн. сотр.; Екатова Т.Ю. – мл. научн. сотр. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

дифференциальную диагностику злокачественных и доброкачественных новообразований, определять степень распространённости опухолевого процесса, выявлять рецидивы и отдалённые метастазы после проведённого лечения, планировать и оценивать эффективность противоопухолевой терапии [2].

Возможность применения 18F-ФДГ в качестве радиотрейсера для визуализации опухолей обусловлена патофизиологическими изменениями раковых клеток. Значимым признаком злокачественного перерождения клеток является нарушение их энергетического обмена, заключающееся в получении энергии преимущественно за счёт гликолиза, а не митохондриального окислительного фосфорилирования, даже в присутствии достаточного количества кислорода [3]. Считается, что такое метаболическое перепрограммирование позволяет опухолевым клеткам поддерживать высокую пролиферативную активность при гипоксии и избегать апоптоза из-за снижения функций митохондрий [3, 4].

Повышенное поступление глюкозы в раковые клетки является важным метаболическим маркером опухолевого процесса. Накопление 18F-ФДГ детерминировано повышенной экспрессией транспортных белков семейства GLUT в опухолевых клетках и возросшей активностью фермента гексокиназы, участвующего в фосфорилировании 18F-ФДГ в 18F-ФДГ-6-фосфат. Полученное соединение не участвует в дальнейшем метаболизме и остаётся внутри клетки, становясь её «метаболической меткой» [3].

Существенным недостатком ¹⁸F является циклотронный способ его получения. Ввиду короткого периода полураспада ¹⁸F (T 1/2 =110 мин), циклотрон должен находиться либо в самом медицинском учреждении, либо недалеко от него [5]. Поэтому были разработаны соединения на основе производных глюкозы и радионуклидов ^99mTc, ¹²³I, ¹¹С, ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, однако лишь ^99mTc-этилендицистеин-деоксиглюкоза находится на этапе клинических исследований [6].

Альтернативой ¹⁸F может стать генераторный радионуклид ⁶⁸Ga, обладающий оптимальными ядерно-физическими свойствами (Т 1/2 =68 мин, β⁺=89%, E⁺ β max =1,9 МэВ). Коммерчески доступный генератор ⁶⁸Ga представляет компактное устройство, позволяющее получать галлий в катионной форме ⁶⁸Ga³⁺ в течение 1-1,5 лет непосредственно в клинике и проводить метку препарата перед введением пациенту. В настоящее время ⁶⁸Ga используется в основном в синтезе меченых производных октреотида [2]. Перспективным направлением считается разработка РФЛП на основе ⁶⁸Ga и фосфоновых кислот [5, 7, 8], а также соединений, обладающих специфичностью к различным рецепторам-биомаркерам [9, 10].

Для введения радиоактивного металла в структуру молекулы предпочтительнее использовать производные глюкозы, имеющие в структуре атом азота или серы, либо бифункциональный хелатор [2]. Поэтому в качестве носителя 68Ga была выбрана аминоглюкоза, связанная с хелатором NODA. Цель работы – изучение фармакокинетических свойств нового соединения на основе NODA-аминоглюкозы и генераторного радионуклида 68Ga (68Ga-NODA-АГ).

Материалы и методы

Получение и контроль качества ⁶⁸Ga-NODA-АГ. Для получения меченого препарата получали лиофилизат NODA-АГ во флаконе ёмкостью 10 см³, содержащий 0,1 мг NODA-АГ. Для этого во флакон помещали 1 мл раствора NODA-АГ, замораживали при -40 ^оС и проводили сушку в сублиматоре («VIRTIS», США) в течение 24 ч.

Далее во флакон с лиофилизатом вносили 0,5 мл деионизованной воды и перемешивали до полного растворения осадка, добавляли 0,5 мл 0,2 М ацетатного буфера с рН 4,6, переме- шивали и добавляли 37 МБк (1,0 мКи) 68GaCl3 в 0,5 мл 0,05 М HCl. Реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре, доводили до объёма 2,0 мл деионизованной водой и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Количественное определение 68Ga, связанного с NODA-АГ, свободного (не связанного с NODA-АГ) и гидролизованного 68Ga осуществляли методом бумажной хроматографии. В качестве неподвижной фазы использовали Ватман-1 (Sigma-Aldrich, США). В качестве подвижных фаз были выбраны 1,0 М раствор ацетата натрия и 0,05% раствор лимонной кислоты. При элюировании 1,0 М раствором натрия ацетата 68Ga, связанный с NODA-АГ, двигался с фронтом элюента (Rf=0,85-0,95), свободный 68Ga оставался на старте (Rf=0). При элюировании 0,05% раствором лимонной кислоты гидролизованный 68Ga незначительно сдвигался со старта (Rf=0,05-0,10), а свободный 68Ga и связанный с NODA-АГ поднимался с фронтом элюента (Rf=0,85-0,95).

Количественное определение гидролизованного, свободного 68Ga и связанного с NODA-АГ проводили путём расчёта результатов радиометрии полосок хроматографической бумаги. Радиометрию проводили с помощью автоматического гамма-счётчика «Wizard» (версия 2480 фирмы PerkinElmer/Wallac, Финляндия).

Полученный РФЛП был предназначен для внутривенных инъекций. Радиохимические примеси в препарате 68Ga-NODA-АГ не превышали 5,0%.

Биологическая часть. В качестве тест-системы использовали беспородных мышей-самцов с массой тела 25±3 г. Животные были поделены на две равные группы по 16 мышей в каждой. Первая группа животных служила контролем: им в хвостовую вену вводили ⁶⁸Ga-NODA-АГ в дозе 0,185 МБк в объёме 0,1 мл. Вторая группа включала животных с перевитой подкожно карциномой Эрлиха. Для получения солидного варианта опухоли Эрлиха перевивали асцитную жидкость, полученную от мышей-доноров на 8-10 сутки роста. Полученную взвесь, содержащую в 0,1 мл 3,5·10⁶ клеток опухоли, вводили подкожно в область правого бедра. Через 7 дней, когда объём опухоли достигал 0,4-0,6 см³, животным внутривенно вводили 0,185 МБк ⁶⁸Ga-NODA-АГ в объёме 0,1 мл.

Через 5 мин, 1, 2 и 3 ч после введения 68Ga-NODA-АГ по 4 животных на каждый срок подвергали эвтаназии путём декапитации (под наркозом), выделяли пробы органов и тканей, помещали их в пластиковые пробирки, взвешивали на электронных весах («Sartorius», Германия) и проводили радиометрию с помощью автоматического гамма-счётчика «Wizard» (версия 2480 фирмы PerkinElmer/Wallac, Финляндия). На момент введения в отдельные пробирки отбирали пробы 68Ga-NODA-АГ в объёме 0,1 мл для использования в качестве стандарта введённой дозы. По данным радиометрии на каждый срок наблюдения рассчитывали количество радиоактивности на 1 г органа или ткани в процентах от введённой дозы (%/г). Также были рассчитаны коэффициенты дифференциального накопления (КДН) как частное от деления величин концентрации активности в опухоли и остальных органах и тканях.

Расчёт периодов полувыведения ⁶⁸Ga-NODA-АГ. Данные о биологических периодах полувыведения ( Т biol ) рассчитывали на основе получения экспоненциальной кривой, исходя из предположения, что активность радионуклида в органе, ткани со временем уменьшается (рис. 1).

Если угловой коэффициент A и константа скорости a максимально точно подобраны для построения кривой, то точка со значением половины введённой активности будет соответствовать биологическому периоду полувыведения T biol . Таким образом, из формулы A(t)=A·e^–at легко выразить биологический период полувыведения T biol :

T biol

1      (  2 A )

- • lnl            I a     I % ID о )

где T biol – биологический период полувыведения препарата из органа или ткани, ч; A – угловой коэффициент при экспоненте; a – константа скорости, ч^-1; %ID 0 – первоначальная доля от введённой активности (percent of Injected Dose) в органе или ткани, %/орган.

Рис. 1. Математическая модель динамики изменения концентрации радиофармпрепарата во времени в органе.

Данные об эффективных периодах полувыведения рассчитывали по формуле:

^T biol " ^T 1 / 2

T eff =                       ’

T biol + T 1 / 2

где T eff – эффективный период полувыведения препарата, ч; T biol – биологический период полувыведения препарата из органа или ткани, ч; T 1/2 – физический период полураспада радионуклида, ч.

Аппроксимация экспериментальных данных и расчёт биологических периодов полувыведения проводились в программе OriginPro 2019b.

Статистическая обработка результатов. При статистической обработке результатов радиометрии определяли показатели средних арифметических значений (М) и стандартных ошибок среднего (±m) в программе Microsoft Excel 2010. Сравнение уровней накопления радиоактивности в группах проводилось с помощью t-критерия Стьюдента в программе OriginPro 2019b. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

При анализе полученных результатов было установлено, что биораспределение 68Ga-NODA-АГ в организме интактных мышей и мышей-опухоленосителей имеет ряд схожих особенностей. Так, пиковые концентрации 68Ga-NODA-АГ в органах были отмечены уже через 5 мин после введения препарата (табл. 1). Важно отметить, что статистически значимые различия в уровнях накопления активности в большинстве внутренних органов между интактными животными и животными с опухолью были выявлены через 5 мин.

Таблица 1

Распределение активности в организме интактных мышей и мышей с карциномой Эрлиха после внутривенного введения 68Ga-NODA-АГ

(в % от введённой дозы на 1 г ткани)

	Наименование органа, ткани	Время после введения препарата
		5 минут	1 час	2 часа	3 часа
1	Кровь	5,35±0,45* 8,41±0,63** р˂0,01	0,53±0,08 0,39±0,05 p>0,1	0,12±0,02 0,04±0,02 р˂0,05	0,110±0,010 0,020±0,001 р˂0,001
2	Лёгкие	4,46±0,66 7,09±0,61 р˂0,05	0,42±0,12 0,44±0,04 p>0,5	0,15±0,04 0,15±0,02 p>0,5	0,12±0,02 0,08±0,01 p>0,1
3	Печень	2,14±0,16 2,68±0,11 р˂0,05	1,40±0,37 1,19±0,13 p>0,5	0,78±0,02 0,99±0,09 p>0,05	0,72±0,10 0,59±0,04 p>0,25
4	Почки	14,21±2,33 24,82±2,87 р˂0,05	3,18±0,29 2,99±0,22 p>0,5	2,84±0,19 2,06±0,23 p<0,05	1,85±0,12 1,79±0,27 p>0,5
5	Сердце	1,85±0,25 3,26±0,13 р˂0,01	0,22±0,04 0,26±0,12 p>0,5	0,09±0,05 0,08±0,01 p>0,5	0,065±0,014 0,010±0,001 p<0,01
6	Селезёнка	1,51±0,06 1,71±0,08 p>0,05	1,17±0,26 0,20±0,01 р˂0,01	1,04±0,27 0,13±0,01 р˂0,01	0,63±0,13 0,07±0,01 р˂0,02
7	Желудок	2,16±0,29 3,98±0,24 р˂0,01	0,25±0,04 0,36±0,12 p>0,25	0,12±0,03 0,13±0,03 p>0,5	0,10±0,04 0,09±0,01 p>0,5
8	Кишечник	1,78±0,36 2,47±0,06 p>0,1	0,25±0,06 0,19±0,04 p>0,25	0,11±0,03 0,12±0,01 p>0,5	0,08±0,01 0,07±0,01 p>0,5
9	Головной мозг	0,21±0,02 0,32±0,04 р˂0,05	0,05±0,01 0,07±0,02 p>0,25	0,04±0,02 0,03±0,01 p>0,5	0,03±0,01 0,02±0,01 p>0,5
10	Мышца бедра	1,42±0,13 2,00±0,07 р˂0,01	0,14±0,04 0,12±0,01 p>0,5	0,05±0,02 0,15±0,06 p>0,1	0,04±0,01 0±0 р˂0,01
11	Кость бедра	2,34±0,36 2,92±0,18 p>0,1	0,22±0,04 0,34±0,10 p>0,25	0,08±0,03 0,34±0,17 p>0,1	0,02±0,01 0,08±0,03 p>0,1
12	Кожа	3,77±0,44 6,96±0,78 р˂0,02	0,42±0,13 0,37±0,12 p>0,5	0,15±0,04 0,21±0,03 p>0,25	0,11±0,04 0,15±0,02 p>0,25
13	Опухоль	3,19±0,53 –	0,93±0,31 –	0,34±0,03 –	0,31±0,05 –

⁶⁸Ga-DOTA-DG клетками эпителиальной карциномы А431 in vivo составило 2,38 %/г в срок 10 мин, снижаясь за 1 ч до 0,39 %/г [11]. Таким образом, содержание ⁶⁸Ga-NODA-АГ в опухоли было более чем в 2 раза выше, чем ⁶⁸Ga-DOTA-DG. Изучение биораспределения другого препарата, ⁶⁸Ga-ECG, проводили на крысах с перевитой подкожно мезотелиомой. Накопление ⁶⁸Ga-ECG в опухоли возрастало со временем до 0,92 %/г в срок 1 ч [12], что схоже с концентрацией ⁶⁸Ga-NODA-АГ через 1 ч после введения.

Таблица 2

Периоды полувыведения активности из органов и тканей интактных мышей и мышей с карциномой Эрлиха после внутривенного введения 68Ga-NODA-АГ

Наименование органа, ткани	Периоды полувыведения, ч
	Интактные мыши		Мыши с карциномой Эрлиха
	T biol	T eff	T biol	T eff
Кровь	0,21	0,18	0,28	0,22
Лёгкие	0,23	0,19	0,28	0,22
Печень	0,53	0,36	0,97	0,52
Почки	0,21	0,18	0,25	0,21
Сердце	0,26	0,21	0,31	0,24
Селезёнка	0,32	0,25	0,51	0,35
Желудок	0,27	0,22	0,31	0,24
Кишечник	0,26	0,21	0,34	0,26
Головной мозг	0,37	0,28	0,26	0,21
Кожа	0,22	0,19	0,30	0,24
Мышца бедра	0,24	0,20	0,28	0,23
Опухоль	–	–	0,43	0,31

Время, ч

• —■— Опухоль/кровь   • Опухоль/мышца

• ▲ Опухоль/печень —V— Опухоль/почки

Рис. 2. Динамика изменения КДН у мышей с карциномой Эрлиха в различные сроки после внутривенного введения ⁶⁸Ga-NODA-АГ.

Диагностическую эффективность 68Ga-NODA-АГ оценивали по коэффициентам дифференциального накопления (КДН), рассчитанным как частное от деления величин концентрации активности в опухоли и остальных органах и тканях. Уже через 5 мин после введения накопление 68Ga-NODA-АГ в опухоли было выше, чем в большинстве органов и тканей. В дальнейшем за счёт ускоренного клиренса внутренних органов по сравнению с опухолевой тканью наблюдался рост численных значений КДН со временем (рис. 2). Отношения опухоль/кровь возрастали с 0,59 в срок 5 мин до 3,43 в срок 2 ч после введения 68Ga-NODA-АГ. КДН опухоль/мышца за

2 ч увеличивались с 2,19 до 8,35. Обращают на себя внимание низкие (меньше 1) значения КДН опухоль/почки, опухоль/печень и опухоль/селезенка, что свидетельствует о повышенной концентрации 68Ga-NODA-АГ в этих органах по сравнению с опухолью.

В крови у мышей с опухолью начальная концентрация 68Ga-NODA-АГ была ниже, чем у интактных мышей, однако в сроки 2 и 3 ч концентрация 68Ga-NODA-АГ у мышей с карциномой Эрлиха была в 3-5,5 раза выше, чем у интактных мышей (p<0,05). У интактных животных концентрация активности в крови составляла 0,02-8,41 %/г, а у мышей с опухолью – 0,11-5,35 %/г (табл. 1).

Наиболее высокий уровень активности был отмечен в почках (табл. 1). У здоровых мышей содержание 68Ga-NODA-АГ в почках достигало 24,82 %/г в срок 5 мин, снижаясь за 1 ч более чем в 8 раз – до 2,99 %/г и продолжая снижаться до конца исследования. У мышей с опухолью максимальное содержание 68Ga-NODA-АГ было существенно ниже (до 14,21 %/г), однако в последующие сроки за счёт быстрого выведения концентрация 68Ga-NODA-АГ в почках быстро снижалась до 1,85-3,18 %/г. Вероятно, это связано с элиминацией препарата через мочевыделительную систему. Высокие уровни радиоактивности в почках были отмечены при введении других аналогов глюкозы, меченных различными радионуклидами [6, 11, 13]. Следует отметить, что минимальные значения периодов полувыведения 68Ga-NODA-АГ в обеих группах животных были отмечены в почках, что свидетельствует о быстром выведении активности из данного органа.

Минимальная концентрация активности была зарегистрирована в головном мозге. У интактных мышей накопление 68Ga-NODA-АГ не превышало 0,32 %/г, а у мышей с опухолью – 0,21 %/г (табл. 1). Эта особенность отличает 68Ga-NODA-АГ и другие меченные 68Ga производные глюкозы от 18F-ФДГ, концентрация которой в головном мозге, по разным данным, может составлять от 2,36 %/г до 5,81 %/г [11, 12]. Поэтому 68Ga-NODA-АГ может применяться для дифференциальной диагностики опухолей головного мозга.

В остальных органах и тканях содержание 68Ga-NODA-АГ было невелико. Лишь у мышей с карциномой Эрлиха была отмечена повышенная концентрация 68Ga-NODA-АГ (0,63-1,51 %/г) в селезёнке (табл. 1). Важно, что в отличие от 18F-ФДГ, накопление 68Ga-NODA-АГ в сердце было низким [11, 12].

Важной особенностью фармакокинетики 68Ga-NODA-АГ в организме мышей-опухоленоси-телей являлось замедленное выведение активности из внутренних органов и тканей по сравнению с интактными животными (табл. 2). Исключение составил лишь головной мозг: выведение 68Ga-NODA-АГ у мышей с опухолью осуществлялось быстрее, чем у здоровых животных. Тем не менее, значения периодов биологического и эффективного полувыведения для обеих групп животных не превышали 1 ч, что является положительной характеристикой диагностического препарата.

Заключение

Таким образом, при внутривенном введении 68Ga-NODA-АГ мышам с карциномой Эрлиха накопление активности в опухоли составило 0,31-3,19 %/г, что превышало аналогичные величины в большинстве органов и тканей на протяжении всего срока наблюдения. Наиболее высо- кий уровень активности как у интактных мышей, так и у мышей с карциномой Эрлиха, был зарегистрирован в почках, а минимальный – в головном мозге. Статистически значимые различия в концентрации 68Ga-NODA-АГ у здоровых животных и животных с опухолью были отмечены преимущественно через 5 мин после введения препарата. Обе группы животных характеризовались быстрым выведением активности из внутренних органов: значения периодов биологического и эффективного полувыведения не превышали 1 ч. При этом выведение 68Ga-NODA-АГ из всех органов и тканей, за исключением головного мозга, у мышей с опухолью осуществлялось медленнее, чем у интактных мышей. Следовательно, параметры фармакокинетики 68Ga-NODA-АГ являются оптимальными для диагностических препаратов, что предполагает возможность применения 68Ga-NODA-АГ для визуализации опухолей.

Исследования проведены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение от 26 ноября 2018 г. № 075-02-2018-097). Уникальный идентификатор проекта RFMEFI57518X0174.