Фармакологические исследования и фармацевтический анализ детских суппозиториев с цетиризина дигидрохлоридом

Цель исследования: изучить антигистаминную активность ЦДХ в суппозиториях, а также разработать оптимальные методики их анализа.

Противогистаминную активность суппозиториев с ЦДХ изучали путем создания модели острого воспалительного отека в опытах на белых крысах-самцах массой 200-210 г. [1, 4]. Отек вызывали субплантарным введением в заднюю лапку крысы 0,25мл 0,01% раствора гистамина. Объем лапок (см3) измеряли онкометром до начала опыта и через 1 час после моделирования отека. Динамику воспалительного отека оценивали через 15 и 60 минут после введения гистамина.

В эксперименте использовали 6 групп животных по 4 крысы в каждой группе. В качестве препарата сравнения выбран раствор ЦДХ. Контрольной группе животных перорально вводили воду очищенную. Второй группе животных вводили водный раствор ЦДХ в дозе 10 мг/кг. Третья группа животных получала суппозиторную основу – плацебо (per rectum) в объеме 0,1 мл/100 г. Четвертой группе животных вводили суппозитории с ЦДХ в дозе 0,02 мг/кг. Пятой группе животных вводили суппозитории с ЦДХ в дозе 0,005 мг/кг, а шестой группе – 0,1 мг/кг. Объем вводимых жидкостей в опытной и контрольной группах животных были эквивалентны. Для выбора доз ЦДХ при приеме per os руководствовались средней терапевтической дозой препарата для ребенка в пересчете на крысу (К=5,9). Так как целью исследований явилось изучение возможности применения ЦДХ в виде суппозиториев, то в суппозиториях содержалась та же доза ЦДХ, что и при приеме per os. Критерием оценки противо-отечного действия ЦДХ являлся объем жидкости (мл), вытесняемый при погружении в нее конечности животного. Статистически обработанные результаты опытов представлены в табл. 1.

Таблица 1. Влияние ЦДХ на выраженность гистаминного отека (n=6)

Условия опыта	Исходный объем лапок, мл3	Изменение объема лапок после введения гистамина, %* )
		15 минут	60 минут
рer os
контроль (вода очищенная)	1,48±0,06	52,3±6,4	46,0±3,7
раствор ЦДХ	1,56±0,01	44,8±2,5	28,1±3,2
рer rectum
контроль (суппозиторная основа-плацебо)	1,76±0,05	28,3±4,5	16,2±1,9
суппозиторий с ЦДХ	1,81±0,02	37,9±4,2	10,5±1,9

Примечание: * результаты с достоверной вероятностью 95% относительно контрольной группы

Установлено, что: при пероральном применении ЦЛХ происходит угнетение гистаминного отека в 1,52 раза относительно животных контрольной группы; ректальное введение ЦДХ приводит к подавлению гистаминного отека в 1,8 раза. Таким образом, разработанные нами суппозитории с ЦДХ в дозе 0,005г можно рекомендовать к использованию для лечения детских аллергических заболеваний.

Далее в задачу наших исследований входила разработка оптимальных методик качественного и количественного анализа ЦДХ в суппозиториях. Для этого учитывали связь структуры исследуемого вещества с его физическими, физико-химическими и химическими свойствами [6]. Цетиризина дигидрохлорид – (RS)-2-{2-[4-[(4-Хлорфенил) фенилметил]-пиперазин-1-ил] этокси}- уксусной кислоты дигидрохлорид представляет собой соль слабого основания и сильной кислоты, поэтому легко растворим в воде и растворим в 95% спирте этиловом. Является производным пиперазина, содержит два третичных амина, два фенильных радикала, органически связанный хлор, простую спиртовую группу и карбоксильную группу. Для идентификации ЦДХ в суппозиториях использовали химические реакции на функциональные группы, а также спектрофотометрический метод. Так как ЦДХ легко растворим в воде, он способен легко высвобождаться из суппозиториев при нагревании.

Исследуемое вещество извлекали из 5 суппозиториев 20-25 мл воды очищенной при нагревании на водяной бане. Извлечение фильтровали. Фильтрат делили на 5 частей и проводили реакции идентификации. Наличие третичной аминогруппы подтверждали реакцией комплексообразования с реактивом Драгендорфа. Простую эфирную группу обнаруживали по образованию ониевого катиона. По появлению светлоголубого осадка (реактив – 5% раствор меди (II) сульфата) судили о наличии карбоксильной группы. При наслаивании кислоты азотной концентрированной появлялось кольцо желтого цвета (фенильные радикалы). Кроме того, для более объективной идентификации цетиризина дигид- рохлорида в суппозиториях использовали электронный спектр поглощения.

Исследуемый раствор готовили следующим образом. ЦДХ извлекали из 1 суппозитория 25мл воды очищенной при нагревании. Извлечение охлаждали, фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл. Фильтрат доводили водой очищенной до метки и перемешивали. 10 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили водой очищенной до метки и перемешивали. Спектр поглощения полученного раствора измеряли в диапазоне длин волн от 200 до 300 нм. В спектре наблюдалась полоса поглощения с максимумом в области 230±2 нм и минимумом 220±2 нм. Полученный электронный спектр поглощения полностью совпадал со спектром поглощения 0,001% водного раствора стандартного образца ЦДХ. Полученные результаты позволили использовать спектрофотометрический метод и для количественного определения ЦДХ в суппозиториях.

Предварительные исследования показали, что оптимальным растворителем с точки зрения получения стабильных и воспроизводимых результатов, является 0,1М раствор кислоты хлористоводородной. В спектре поглощения 0,001% раствора ЦДХ в 0,1М растворе кислоты хлористоводородной наблюдается полоса поглощения с одним максимумом в области 231±2 нм и минимумом в области 219±2нм. Подчинение солянокислых растворов закону Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в диапазоне концентраций от 0,0005 до 0,0035% (рис. 1).

Рис. 1. Градуировочный график ЦДХ в 0,1М растворе кислоты хлористоводородной

Для подтверждения линейной зависимости нами расчитано уравнение градуировачного графика, а так же коэффициент корреляции (r). Данные представленны в табл. 2.

Согласно требованиям ОФС 42-0111-09 угловой и свободный коэффициенты линейной зависимости рассчитывали по формулам:

т£А₁ С^—ЕС^ХА^ b=

SAi-bSq a=            ,

т

,

где b - угловой коэффициент линейной зависимости; a – свободный коэффициент линейной зависимости.

Таблица 2. Исходные данные для расчета градуировочного графика (m=6)

№ п/п	Концентрация раствора цетиризина дигидрохлорида ( C i ), %	Оптическая плотность ( A i )	A i 2	C2	А·С
1	0,0005	0,175	0,030625	0,00000025	0,0000875
2	0,0010	0,360	0,129600	0,00000100	0,0003600
3	0,0015	0,545	0,297025	0,00000225	0,0008175
4	0,0020	0,725	0,525625	0,00000400	0,0014500
5	0,0025	0,910	0,828100	0,00000625	0,0022750
6	0,0030	1,095	1,199025	0,00000900	0,0032850
2	0,0105	3,810	3,010000	0,00002275	0,0082750

Уравнение градуировочного графика принимает следующий вид:

А=367,43с – 0,008, (3)

где А – оптическая плотность; 367,43 – угловой коэффициент линейной зависимости; -0,008 – свободный коэффициент линейной зависимости.

Нами была разработана методика количественного спектрофотометрического определения ЦДХ в детских суппозиториях, которая заключается в следующем: 1 суппозиторий помещают в коническую колбу вместимостью 200 мл, прибавляют 30-40 мл 0,1М раствора кислоты хлористоводородной и ставят на кипящую водяную баню до полного расплавления суппозитория при постоянном перемешивании в течение 20 минут. Затем содержимое охлаждают и фильтруют через двойной фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Аналогичную операцию повторяют дважды, фильтраты объединяют, объем раствора доводят 0,1М раствором кислоты хлористоводородной до метки и перемешивают (раствор А). 25 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки и перемешивают. Оптическую плотность полученного раствора измеряли в кварцевых кюветах относительно растворителя на спектрофотометре при λmax = 231нм. Содержание ЦДХ в одном суппозитории (x) в граммах рассчитывали по уравнению градуировочного графика по формуле:

(Aj-ayw^

x (г) =                      , (4)

где ( А i – a )/ b – концентрация ( C i ) ЦДХ, %; W 1 , W 2 – объемы мерных колб, мл; v – аликвота, мл.

Статистически обработанные результаты 7 параллельных определений представлены в табл. 3.

Таблица 3. Результаты количественного спектрофотометрического определения ЦДХ в одном суппозитории

№ п/п	Оптическая плотность A i	Найдено ( X i ), г	Метрологические характеристики
1	0,452	0,00501	=0,00493; S2 =6,76 SD =2,6; RSD=±2,61 =0,98; Δ x =2,4 = ±2,4%
2	0,455	0,00504
3	0,440	0,00488
4	0,458	0,00508
5	0,437	0,00484
6	0,443	0,00492
7	0,428	0,00476

Относительная погрешность определения не превышает ±2,4%.

Валидность предложенной методики устанавливали по критериям «Правильность», «Линейность» и «Прецизионность». «Линейность» методики устанавливали на основании коэффициента корреляции (r) градуировочного графика, рассчитанного по формуле, приведенной в ОФС 42-0111-09. Правильность методики определяли по двум критериям: «Открывае-мость» и рассчитанному коэффициенту Стьюдента. Открываемость устанавливали по трем уровням концентраций растворов, приготовленных из исходного раствора А, полученного из искусственной смеси, сос-тоящей их 0,0500 г ЦДХ и 10,0 г основы. В качестве растворителя служил

0,1 М раствор кислоты хлористоводородной. Были приготовлены три серии растворов по три раствора в каждой. Их оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны λ max = 231нм.

Количественное содержание ЦДХ рассчитывали по уравнению градуировочного графика (см. выше). «Открываемость» (R) рассчитывали по формуле:

найдено аналита (г) взято аналита (г)

-100%

Результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4. Результаты установления точности методики с использованием «открываемости»

№ п/п	Уровень	Концентрация (%)	Взято цетиризина дигидрохлорида (г)	Оптическая плотность ( А , +0,008)	Найдено цетиризина дигидрохлорида (г)	Откры-вае-мость R (%)	Метроло гические характеристики
1	1	0,000625	0,0500	0,226	0,0492	98,4	R ср =99,6%
2	1	0,000625	-//-	0,228	0,0496	99,2
3	1	0,000625	-//-	0,231	0,0503	100,6
4	2	0,001250	-//-	0,451	0,0491	98,2
5	2	0,001250	-//-	0,456	0,0496	99,2	SD=0,9%
6	2	0,001250	-//-	0,462	0,0504	100,8	t=1,33
7	3	0,001875	-//-	0,692	0,0501	100,2	t таб =3,37
8	3	0,001875	-//-	0,690	0,0500	100,0
9	3	0,001875	-//-	0,688	0,0499	99,8

Так как расчетный коэффициент Стьюдента меньше табличного, методика не отягощена систематической ошибкой и поэтому может считаться правильной.

«Прецизионность» методики устанавливали по результатам девяти параллельных определений. Исходный раствор (раствор А) готовили аналогично раствору А (см. раздел «Правильность»). Затем в девять мерных колб вместимость. 100 мл помещали по 2,5 мл раствора А, доводили объем растворов 0,1М кислоты хлористоводородной до метки и перемешивали. Оптическую плотность полученных растворов измеряли в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1см при λmax=231 нм относительно растворителя (табл. 5).

Результаты проведенной валидацион-ной оценки методики приведены в табл. 6. Полученные данные свидетельствуют о пригодности методики для аналитических целей.

Таблица 5. Результаты установления «Прецизионности»

№ п/п	Взято вещества (г)	Оптическая плотность ( А , +0,008)	Найдено (г)	Метрологические характеристики
1	0,0500	0,456	0,0496	Х ср =0,00498 SD=0,72
2	-//-	0,454	0,0494
3	-//-	0,461	0,0502
4	-//-	0,458	0,0498
5	-//-	0,459	0,0499
6	-//-	0,462	0,0503
7	-//-	0,455	0,0495
8	-//-	0,457	0,0497
9	-//-	0,460	0,0500

Таблица 6. Результаты валидационной оценки методики количественного спектрофотометрического определения ЦДХ в суппозиториях

№ п/п	Определяемый критерий	Результат	Требования НД
1	открываемость (R ср )	99,60%	99-101%
2	правильность (коэффициент Стьюдента t)	1,33	3,37
3	уравнение градуировочного графика	А=367,4с – 0,008	-
4	линейность (коэффициент корреляции r)	0,997	~1,0
5	прецизионность (SD)	0,72	не более 3,0

Выводы:

• 1.    Фармакологическими исследованиями доказана антигистаминная активность разработанных нами ранее детских суппозиториев с ЦДХ, которые подавляли выраженность гистаминового отека в 1,8 раза по сравнению с пероральным применением.

• 2.    Разработаны методики качественного и количественного определения ЦДХ с использованием химических и оптических методов.

• 3.    Проведена валидационная оценка методики количественного спектрофотометрического определения ЦДХ в суппозиториях.