Фенольные соединения листьев какалии копьевидной (Cacalia hastata L.)

Какалия копьевидная Cacalia hastata L. семейство Астровые Asteraceae Dumort. – лекарственное растение, которое издавна применяется в народной и тибетской медицине как ранозаживляющее и кровоостанавливающее средство, при лечении простудных заболеваний и болезней печени [1].

Cacalia hastata – многолетнее корневищное травянистое растение высотой до 190 см, широко распространено в России; за рубежом встречается на севере Монголии, северо-востоке Китая, Корее, Японии, Северной Америке. C. hastata встречается в разреженных хвойных или мелколиственных лесах, изредка в борах; по опушкам смешанных лесов, в березняках и зарослях ольховника и кедрового стланика. На Дальнем Востоке - также в дубовых лесах, по приречным долинам, в кустарниковых зарослях, на лесных и приречных лугах, в горах по речным долинам в лесном поясе, местами поднимается до нижней части альпийского пояса [2].

Химический состав C. hastata разнообразен и представлен различными группами биологически активных веществ. Из листьев C. hastata были выделены алкалоиды [3], сесквитерпены [4-7], тритерпены [8], каротиноиды [9]. В составе свободных углеводов листьев C. hastata установлено наличие фруктозы, глюкозы и галактозы. Из комплекса водорастворимых полисахаридов выделены глюкоарабиногалактан (какалан А) и два арабиногалактана (какаланы В и С). Пектиновые вещества листьев C. hastata относятся к классу высокоэтерифицированных пектинов, а гемицеллюлозные производные группы А являются ксилоглюкофруктанами, группы Б – ксиланами [10].

Для листьев C. hastata характерно высокое содержание компонентов цикла ди- и трикарбоновых кислот – до 7.2% [11]. Фенольные соединения листьев C. hastata представлены кумаринами и дубильными веществами [12]. Также в C. hastata обнаружены фотосинтетические пигменты [9], аскорбиновая кислота [13], тиамин (2.34±0.14 мг%) и рибофлавин (3.19±0.20 мг%) [12].

Целью настоящей работы является детальное исследование состава фенольных соединений листьев C. hastata .

Экспериментальная часть

Растительное сырье – листья C. hastata были собраны в Мухоршибирском районе (с. Мухорши-бирь) в июле 2008 г. Видовая принадлежность определена д. фарм. н. Асеевой Т.А. (ИОЭБ СО РАН). Образец сырья хранится в гербарии Отдела биологически активных соединений ИОЭБ СО РАН (№ At/f-51/4-07/0807).

Колоночную хроматографию проводили на силикагеле L 100/400 (Chemapol) и полиамиде (Woelm), гель-хроматографию – на Сефадексе LH-20 (Pharmacia), препаративную ТСХ – на пластинах с силикагелем Сорбфил ПТСХ-П-А (Имид Ltd.), ВЭТСХ – на пластинах с силикагелем Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Имид Ltd.). Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре UV-Vis-mini (Shimadzu). Оптическое вращение определяли на поляриметре СМ-3 (Загорский оптикомеханический завод). ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum 100 (Perkin-Elmer) в пленке на пластинах КРС-5 в интервале 4000-650 см-1. ГХ/МС анализ проводили на хромато-масс-спектрометре 5973 N (Agilent Technologies) с масс-селективным детектором 6890N (Agilent Technologies) с диффузным насосом с применением капиллярной колонки PH-Innowax (30 м/250 мкм/0.50 мкм). Спектры 13С-ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре VXR 500S (Varian) с рабочей частотой 125.7 МГц для 1% растворов веществ в ДМСО-d6. ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02 (Эконова), колонка Nucleosil 100-5 C18 (5 μм, 75×2 мм), градиентный режим элюирования (А – 0.05 М КН2РО4/МеCN 95:5, В – МеОН), v = 0.15 мл/мин, Т = 35°С, УФ-детектор при λ = 202, 224, 270, 278 нм. В ходе анализа определялись хроматографическая подвижность, спектр в остановленном потоке растворителя, спектральные соотношения, а также проводились опыты с добавками стандартных соединений.

Высушенное измельченное сырье (520 г) экстрагировали пятикратно 80%-ным этанолом (модуль 1:25) при 80°С. Объединенное спиртовое извлечение концентрировали до водного остатка, который подвергали жидкофазной экстракции гексаном, хлороформом, этилацетатом и н -бутанолом что привело к получению следующих фракций: гексановой (22.31 г; 4.29% от массы возд.-сух. сырья), хлороформной (33.80 г; 6.50%), этилацетатной (4.58 г; 0.88%), бутанольной (40.14 г; 7.72%) и водного остатка (107.17 г; 20.61%). Общий выход экстрактивных веществ составил 40% от массы воздушно-сухого сырья.

Для разделения хлороформной фракции (20 г) применяли колоночную хроматографию на силикагеле (3×50 см) в системах гексан-хлороформ (100:0→70:30) и хлороформ-метанол (100:0→50:50) с последующей рехроматографией в условиях гель-хроматографии на LH-20 (2×40 см) в градиентной системе хлороформ-метанол (100:0→0:100), препаративной ТСХ (система толуол-этилацетат-муравьиная кислота 3:3:1) и ВЭТСХ (система петролейный эфир-диэтиловый эфир-муравьиная кислота 9:4:1). В результате выделено пять соединений: 1 (11 мг), 2 (9 мг), 3 (25 мг), 4 (14 мг) и 5 (5 мг).

Этилацетатное (4.2 г) извлечение (7 г) хроматографировали на SiO 2 -колонке (2×30 см) в системах хлороформ-ацетон (100:0→70:30), ацетон-этанол (100:0→50:50), этанол-вода (95:5→40:60). Субфракции разделяли на колонках с полиамидом (2×20 см; элюент этанол-вода 0:100→95:5, ацетон) с последующей препаративной ТСХ (системы толуол-этилацетат-муравьиная кислота 5:4:1, этилацетат-метанол-вода 9.6:1.9:1). Хроматографическое разделение этилацетатной фракции привело к выделению шести соединений: 6 (22 мг), 7 (28 мг), 8 (7 мг), 9 (16 мг), 10 (18 мг) и 11 (84 мг). Выделенные вещества были идентифицированы по данным физико-химического анализа (температура плавления, оптическое вращение), а также УФ-, ИК-, ¹³С-ЯМР-спектроскопии и МС.

	R 1	R 2
( 3 )	OH	OH
( 4 )	OH	OCH
( 5 )	ОН	Н

( 6 )                                          ( 7 )

Рис. Структурные формулы соединений, выделенных из листьев C. hastata. Gal – галактоза, Rut – рутиноза

Обсуждение результатов

В результате фракционирования экстрактивных веществ листьев C. hastata был получен ряд узких фракций. Хроматографическое разделение хлороформной и этилацетатной фракций с применением колоночной хроматографии на силикагеле, полиамиде, Сефадексе LH-20, а также препаративной ТСХ и ВЭТСХ, позволило выделить 11 соединений, идентификацию которых проводили с использованием данных физико-химического анализа, УФ-, ИК- ¹³С-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрического анализа.

Выделенные соединения относятся к классам флавоноидов – кемпферол ( 1 ; 3,5,7,4'-тетрагидроксифлавон), кверцетин ( 2 ; 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавон), гиперозид ( 9 ; 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона 3- О -β-галактозид), рутин ( 11 ; 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона 3- О -рутинозид); катехинов – (+)-катехин ( 8 ; 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаван); кумаринов – умбеллиферон ( 3 ; 6,7-дигидроксикумарин), скополетин ( 4 ; 6-метокси-7-гидроксикумарин), эскулетин ( 5 ; 7-гидроксикумарин); фенольных кислот – галловая ( 6 ; 3,4,5-тригидроксибензойная кислота); фенилпропаноидов – кофейная ( 7 ; 3,4-дигидроксикоричная кислота), хлорогеновая кислоты ( 10 ; 3-кофеил-хинная кислота) (рис.). Соединения 3 - 7 , 10 были ранее выделены из C. hastata [7, 14], а 1 , 2 , 8 , 9 , 11 – обнаружены в данном растительном виде впервые. Доминирующим соединением фенольного комплекса листьев C. hastata является хлорогеновая кислота ( 10 ); в составе флавоноидов преобладает рутин ( 11 ).С применением метода ВЭЖХ проведен количественный анализ состава спиртового экстракта (70% этанол) из листьев C. has-tata (табл.). Установлено, что содержание хлорогеновой кислоты ( 10 ) и рутина ( 11 ) – 18.72 и 9.94 мг/г, соответственно; в пересчете на сырье эти показатели составляют 7.84 и 4.32 мг/г от массы воздушносухого сырья.

Полученные результаты расширяют сведения о химическом составе C. hastata и позволяют определить данный растительный вид в качестве перспективного для дальнейшего химического и фармакологического исследований.

Таблица

Содержание фенольных соединений в спиртовом извлечении и сырье C. Hastate

Соединение	Содержание, мг/г
	в спиртовом экстракте	в сырье
( 1 )	2.04±0.06	0.86±0.03
( 2 )	1.14±0.03	0.67±0.02
( 3 )	0.42±0.01	0.183±0.005
( 4 )	0.64±0.02	0.282±0.008
( 5 )	0.052±0.002	0.027±0.001
( 6 )	8.63±0.26	3.77±0.11
( 7 )	12.84±0.36	5.21±0.16
( 8 )	2.33±0.07	0.97±0.03
( 9 )	2.88±0.09	1.15±0.04
( 10 )	18.72±0.56	7.84±0.24
( 11 )	9.94±0.30	4.32±0.12

Заключение

В результате химического исследования из листьев C. hastatа выделено 11 соединений фенольной природы, 5 из которых обнаружены в данном растительном виде впервые (кемпферол, кверцетин, гипе-розид, (+)-катехин, рутин).