Фенотипическая вариабельность реакции нейронов головного мозга. Хроническое действие токсинов при высокой и низкой чувствительности к ним

DOI:

Прогресс в области нейроморфологии в последние десятилетия привел к тому, что в головном мозге (ГМ) детально изучено свыше 200 структурных образований, для них установлены (как у лабораторных животных, так и у человека) множество структурных, ульт-раструктурных, гистохимических и иммуногистохимических особенностей, имеющих генетическую детерминированность [11; 15; 23].

Это предопределяет фенотипическую гетерогеность популяций в отношении чувствительности к различным нейротропным воздействиям [4; 6]. На морфологическом уровне показан ряд специфических признаков повышенной чувствительности к таким токсинам в виде особенностей строения коры головного мозга, ядер гипоталамуса, продолговатого мозга, вегетативных ганглиев внутренних органов [7; 8; 14].

Молекулярные маркеры различий такой чувствительности кроются в особенностях экспрессии в нервной ткани ферментов, отвечающих за обмен ключевых нейромедиаторов [1; 3; 22], функциональную активность нейроглиальных клеток и сосудистного эндотелия [13; 16; 26], а также связанных с регуляцией и реализацией апоптоза клеток [12; 20; 21].

Мы поставили своей задачей сопоставить степень повреждения нейронов, нейроглиальных соотношений и экспрессии ряда молекулярных маркеров в ключевых структурах головного мозга, чувствительных к интоксикации.

Методика исследования

Эксперименты проводили с использованием 25 белых крыс-самцов линии Wistar массой 240–290 г, руководствуясь этическими нормами, изложенными в «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Директиве 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях. Для выведения животных из эксперимента использовали передозировку «Золетила» (150 мг/кг массы).

Для первой группы были предварительно отобраны по времени этанолового сна по 5 животных с максимально быстрым (Б) и максимально медленным (М) метаболизмом этанола. Животные каждой подгруппы были подвергнуты 30-суточной принудительной пероральной алкоголизации в дозе 1 мл/кг этанола в сутки. Во второй группе на основании результатов измерения 30-минутного градиента температуры при действии 0,1 мг/кг липополисахарида (ЛПС) S. Thyphimurium внутрибрюшинно [5] выделили две подгруппы по 5 животных с высокой (В) и низкой (Н) чувствительностью к этому токсину. Их подвергали хронической интоксикации бактериальным ЛПС в той же дозе каждые 48 ч в течение 30 суток. Пять интактных животных составили группу контроля (рис. 1).

Непосредственно после эвтаназии ГМ животных извлекали щадящим образом из черепа, помещали в 10 %-ный раствор нейтрального забуференного формалина (рН = 7,4)

Рис. 1. Общий дизайн эксперимента

на 30 мин. После этого разделяли на 3 блока (А, В и С) фронтальной секцией через точку P0 в координатах Хорслей – Кларка и тангенциальной – от борозды, разделяющей полушария большого мозга и мозжечка до границы между стволом и промежуточным мозгом на вентральной его поверхности. Материал до-фиксировали в том же растворе в течение 24 ч. С фронтальной (А, В) и вентро-фрональ-ной (С) поверхностей каждого блока делали серийные срезы толщиной 5–7 мкм. Использовали окраски гематоксилином и эозином и тионином по Нисслю. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных антител производства Dako (Дания) к нейрональной (NOS-1) и эндотелиальной (NOS-3) нитроксидсинтазам, маркеру ФНО-зависимого апоптоза (TRAIL). В результате удавалось идентифицировать на срезах и дать качественную и полуколиче-ственную оценку фенотипа нейронов следующих локализаций: передней фронтальной области коры больших полушарий ГМ, стриатума, переднего гипоталамуса, коры мозжечка, а также продолговатого мозга [25]. Эти локализации были выбраны, поскольку с ними, по данным литературы, связываются наиболее типичные изменения в головном мозге, вызванные хронической интоксикацией [4; 9; 19].

Фотосъемку препаратов проводили на микроскопе БИМАМ Р-13 («Ломо», Россия) с фотокамерой TK-C620E JVC (Japan), после чего осуществляли количественное морфологическое исследование с использованием программы свободного доступа Image Tool (Union B, США). Рассчитывали относительную степень повреждения нейронов (в отн. ед.), нейроглиальное соотношение, а также интенсивность экспрессии молекулярных маркеров («–» – негативная, «+» – слабо выраженная, «++» – умеренно выраженная, «+++» – гиперэкспрессия).

Обработку количественных данных проводили с помощью программы Statistica 10 (StatSoft Inc., США) с учетом отсутствия нормального характера распределения в выборках. Распределение в группах выражали в виде медианы и интервала между первым и третьим квартилем (Ме [Q1; Q3], на графиках – в виде вертикальных отрезков у столбиков). При сравнении результатов проведен дисперсион- ный анализ с использованием непараметрического критерия Фридмана для множественных групп (p < 0,01), для анализа различий внутри каждой подгруппы – непараметрический критерий Манна – Уитни (p < 0,01).

Результаты и их обсуждение

В нейронах всех изученных областей головного мозга на фоне хронической интоксикации выявлялись классические признаки повреждения нейронов в виде пикноза и латерализации ядра, уплотнения и гомогенизации рисунка цитоплазмы перикариона, перицеллюлярного отека и признаков их необратимой гибели вплоть до формирования клеток-теней. Повреждение и гибель нейронов сопровождались сосудистой и глиальной реакцией с увеличением соотношения глия/ нейрон.

В результате сопоставления изменений в различных отделах головного мозга животных опытных групп было выявлено, что максимальные изменения при хронической интоксикации (в виде увеличения нейроглиального соотношения, повышения доли нейронов с признаками обратимого и необратимого повреждения) были характерны для третьего и пятого слоев фронтальной коры, крупноклеточных ядер переднего гипоталамуса и вегетативных ядер продолговатого мозга (см. табл. 1, 2).

Сравнение между подгруппами (М и Б в первой группе; Н и В – во второй группе) выявило, что максимальные различия, связанные с высокой и низкой чувствительностью к токсинам, также характерны для фронтальной коры и переднего гипоталамуса.

Иммуногистохимическое исследование выявило, что повреждение нейронов сопровождалось изменением экспрессии нейрональной и эндотелиальной нитроксидсинтаз, а также лиганда ФНО-зависимого апоптоза TRAIL с общей тенденцией к увеличению экспрессии от умеренно выраженной до ги-перэкспресии.

В большинстве случаев иммунопозитив-ный материал был распределен неравномерно в цитоплазме, образуя скопления по периферии перикарионов, а для NOS-3 – в эндотелии сосудов (см. рис. 2).

Таблица 1

Относительная степень повреждения нейронов в различных отделах головного мозга крыс при хронической интоксикации в течение 30 суток

Локализация	Первая группа (этанол)		Вторая группа (ЛПС)
	Подгруппа М	Подгруппа Б	Подгруппа Н	Подгруппа В
Кора ГМ	15,6 [13,3÷18,4]	42,7 [33,8÷44,9] *	14,1 [12,5÷16,6]	35,0 [32,4÷42,7] *
Стриатум	9,3 [7,7÷10,5]	12,5 [9,8÷15,0]	7,5 [6,2÷9,1]	15,8 [12,6÷18,2] *
Гипоталамус	17,3 [14,6÷20,1]	39,6 [33,8÷44,9] *	14,1 [12,5÷16,6]	35,0 [32,4÷42,7] *
Мозжечок	10,1 [8,1÷11,9]	13,2 [10,1÷15,9]	8,8 [6,7÷9,8]	14,6 [12,9÷17,0] *
Продолговатый мозг	15,5 [13,3÷18,6]	30,5 [25,6÷34,7] *	15,2 [13,5÷18,4]	32,8 [27,9÷37,0] *

Примечание. * – достоверные различия между подгруппами.

Таблица 2

Изменение нейроглиального соотношения в различных отделах головного мозга крыс при хронической интоксикации в течение 30 суток

Локализация	Первая группа (этанол)		Вторая группа (ЛПС)
	Подгруппа М	Подгруппа Б	Подгруппа Н	Подгруппа В
Кора ГМ	14,2 [11,0÷17,2]	19,9 [15,6÷23,2] *	13,6 [11,4÷17,5]	20,8 [16,1÷26,2] *
Стриатум	6,8 [5,9÷8,1]	8,0 [6,2÷9,7]	6,6 [5,7÷7,9]	7,7 [5,9÷9,5]
Гипоталамус	7,6 [6,7÷7,5]	5,2 [4,8÷5,9] *	7,9 [6,8÷8,7]	5,4 [4,8÷6,4] *
Мозжечок	6,0 [5,3÷6,9]	6,6 [5,6÷7,5]	6,1 [5,5÷7,2]	6,9 [6,0÷7,3]
Продолговатый мозг	12,5 [9,9÷14,7]	16,2 [12,4÷17,6]	11,8 [9,6÷13,3]	15,6 [12,0÷19,2]

Примечание. * – достоверные различия между подгруппами.

Рис. 2. Варианты экспрессии изученных маркеров в ткани головного мозга крыс при хронической интоксикации:

А – умеренная экспрессия TRAIL; Б – высокая экспрессия TRAIL; В – умеренная экспрессия NOS-1; Г – гиперэкспрессия NOS-1; Д – умеренная экспрессия NOS-3; Е – гиперэкспрессия NOS-3.

Окраска: моноклональные антитела к маркерам, пероксидазный метод. х 300

Наиболее интенсивные изменения экспрессии касались эндотелиальной нитроксид-синтазы и TRAIL, локализация наиболее ярких изменений соответствовала ранее описанным областям с наиболее выраженными изменениями нейронов и глиальной реакции (табл. 3).

Проведенное исследование выявило, как минимум, три момента, требующих обсуждения. Во-первых, фронтальная кора и передний гипоталамус оказались наиболее поражаемыми из изученных областей ГМ при хронической интоксикации. Далее, у животных, более чувствительных к воздействию токсинов, изменения в этих областях ГМ развивались более интенсивно. Наконец, при общем сходстве интоксикации этанолом и ЛПС картина повреждения нейронов, а также реакции нейроглии и сосудов на нее представляется достаточно вариабельной.

При анализе выявленных особенностей необходимо принимать во внимание такие важнейшие моменты, как исходно различная функциональная нагрузка, сложность нейроглиальных отношений и сосудистых реакций в конкретной области ГМ, а также ее вовлеченность в процессы управления детоксикацией организма [7; 8; 10; 18]. Кроме того, важным мо- ментом при анализе динамики хронического процесса в нервной системе является способность нейронов к внутриклеточной регенерации [2; 23].

Несмотря на достаточно ограниченное количество общепатологических механизмов повреждения нейронов при интоксикациях (прежде всего – активация свободно-радикальных процессов, дефицит энергетических субстратов и дисбаланс регуляторных молекул) [5; 10; 17; 24], специфические механизмы, присущие конкретному токсину, могут существенно моделировать интенсивность неспецифических и влиять на фенотип нейронного повреждения. При прочих равных, относительно более сложная организация нейронного окружения, высокое глиальное представительство, исходно высокая активность эндотелиальной нитроксидсинтазы и низкая экспрессия TRAIL могут считаться фенотипом, соответствующим более высокой резистентности данной области ГМ к хроническому токсическому повреждению.

Заключение

Экспериментальная хроническая интоксикация этанолом или бактериальным ЛПС

Таблица 3

Экспрессия иммуногистохимических маркеров в различных отделах головного мозга крыс при хронической интоксикации в течение 30 суток

Маркер Контроль Первая группа (этанол) Вторая группа (ЛПС) Подгруппа М Подгруппа Б Подгруппа Н Подгруппа В Кора ГМ NOS-1 + + ++ + ++ NOS-3 + +++ +++ ++ +++ TRAIL – ++ +++ ++ +++ Стриатум NOS-1 + + ++ + ++ NOS-3 – + + + ++ TRAIL – + ++ ++ ++ Гипоталамус NOS-1 ++ + ++ + ++ NOS-3 + +++ +++ ++ +++ TRAIL + ++ +++ ++ +++ Мозжечок NOS-1 + + + + + NOS-3 – + ++ + ++ TRAIL – + ++ + ++ Продолговатый мозг NOS-1 + + + + + NOS-3 – + ++ + ++ TRAIL + + ++ ++ +++ как примерами веществ с различными механизмами действия на клетки вызывает в нейронах центральной нервной системы во многом однотипные изменения. Фенотип повреждения нейронов варьируется в различных областях ГМ с максимальной выраженностью во фронтальной коре и ядрах переднего гипоталамуса. Конституциональная чувствительность к токсинам предопределяет более интенсивные изменения нейронов, реакции глиальных клеток и эндотелия сосудов. Полученные данные свидетельствуют о наличии молекулярных предикторов повышенной чувствительности нейронов к хроническому токсическому воздействию, в том числе связанных с механизмами нейроглиальных отношений, балансом нитроксидсинтаз и управлением апоптозом нейронов. Они безусловно определяют итоговую чувствительность к нейротропным экзогенным токсическим воздействиям, конкретная величина которой определяется также спецификой действующего токсического агента и видом животного.