Фенотипические особенности гранулоцитов низкой плотности при физиологической беременности

Физиологическая беременность характеризуется глубокими изменениями функций клеток как адаптивного, так и врожденного иммунитета, что необходимо для выживания полуаллогенного плода и сохранения защитных свойств организма матери [Ширшев, 2009]. Нейтрофилы преобладают среди гранулоцитов периферической крови и являются ведущими эффекторами врожденного иммунитета. Их функции не ограничиваются обеспечением противомикробной защиты. Нейтрофилы активно инфильтруют ткани матки, стимулируют ангиогенез, выполняют регуляторные функции, участвуют в репарации, а стимуляция их фагоцитарной и цитотоксической активности ассоциирована со спонтанными абортами [Циркин и др., 2015; Потапнев, Гущина, Мороз, 2019]. При физиологической беременности происходит увеличение относительного и абсолютного содержания нейтрофилов в периферической крови, их фагоцитарная и цитотоксическая активность снижается, что является частью системного гормон-зависимого угнетения цитотоксических реакций при беременности и необходимо для сохранения плода [Ширшев, Куклина, Баженова, 2008; Патурова и др., 2018].

Физиологическая беременность характеризуется увеличением количества нейтрофилов низкой плотности [Denny et al., 2010; Ssemaganda et al., 2014; Ye et al., 2023]. Нейтрофилы низкой плотности выделяются вместе с фракцией мононуклеарных клеток периферической крови при разделении методом седиментации на градиенте плотности фиколл-урографина (1.077 г/см3) [Denny et al., 2010; Ye et al., 2023]. Подобные клетки присутствуют и у здоровых доноров вне беременности, но не превышают 1–2% [Denny et al., 2010; Ye et al., 2023]. Количество нейтрофилов низкой плотности значительно повышается при воспалении, аутоиммунных процессах, онкологических заболеваниях [Denny et al., 2010; Carmona-Rivera, Kaplan, 2013; Yang et al., 2019; Ning, Wang, Jin, 2022]. При подобных патологических состояниях нейтрофилы низкой плотности характеризуются как преимущественно незрелые, избыточно экспрессирующие маркеры активации, способные к спонтанному формированию нейтрофильных ловушек, активной продукции провоспалительных цитокинов и цитотоксичности в отношении эндотелиальных клеток [Denny et al., 2010; Carmona-Rivera, Kaplan, 2013; Yang et al., 2019; Ning, Wang, Jin, 2022]. При физиологической беременности нейтрофилы низкой плотности не отличаются по маркерам зрело- сти/дифференцировки, активационного статуса, бактерицидности от нейтрофилов нормальной плотности [Ssemaganda et al., 2014; Deniset, Kubes, 2018], но имеют сниженную фагоцитарную активность [Denny et al., 2010; Ye et al., 2023]. Предполагается, что эти клетки способны к индукции формирования Т-регуляторных лимфоцитов в зоне фето-плацентарного контакта [Ssemaganda et al., 2014; Deniset, Kubes, 2018]. Однако их функциональные особенности, как и динамика их численности при физиологической беременности, остаются малоизученными.

Нейтрофилы периферической крови отличаются по экспрессии молекулы CD16 – рецептора к Fc-фрагментам IgG, необходимого для фагоцитоза IgG-опсонизированных патогенов [Asakura et al., 2002]. Гранулоциты с высокой экспрессией CD16 (CD16hi) и средней экспрессией CD16 (CD16int) дифференцированы по степени зрелости и характеризуются разной адгезионной способностью к активированному эндотелию и экстравазации, что определяет их разную активность при воспалении, дополнительно предполагая участие в изменении иммунореактивности при беременности [Boron et al., 2022]. В немногочисленных исследованиях показано, что нарушение субпопуляционного состава CD16hi- и CD16int-нейтрофилов и их функций ассоциировано со спонтанными абортами в ранние сроки беременности [Рапопорт, Курмышкина, Бовин, 2008]. В наших предыдущих исследованиях показано, что при физиологической беременности нарастает доля (CD16int) нейтрофилов в общем пуле гранулоцитов периферической крови, а количество CD16hi гранулоцитов снижается, метаболическая активность CD16hi- и CD16int-нейтрофилов увеличивается к концу беременности [Орлова и др., 2024]. Однако особенности экспрессии CD16 на гранулоцитах низкой плотности и их метаболический статус при физиологической беременности не изучены.

В большинстве работ гранулоциты низкой плотности описываются как избыточно активированные клетки, что предполагает их высокую метаболическую активность [Denny et al., 2010; Carmona-Rivera, Kaplan, 2013; Yang et al., 2019; Ning, Wang, Jin, 2022]. Для большинства клеток иммунной системы глюкоза является основным энергетическим субстратом и поступает в клетку при помощи белков-транспортеров (GLUT-1), а количество и состояние митохондрий отражают активность основных метаболических путей [Stojkov et al., 2022]. Поэтому целью данной работы является изучение экспрессии молекул, характеризующих цитотоксичность (CD16, CD107a), транспорт глюкозы (GLUT-1) и состояние митохондрий (MitoSpyT M Green FM) нейтрофилов низкой плотности и общей фракции гранулоцитов в разные триместры физиологической беременности.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлась венозная кровь женщин в I и в III триместрах физиологической беременности (табл. 1). Группу сравнения составили условно-здоровые небеременные женщины в фолликулярной фазе менструального цикла, сравнимые по возрасту с исследуемыми группами. Использовались следующие критерии включения: добровольное информированное согласие на использование биологического материала, наличие одной и более успешных беременностей; отсутствие патологий беременности в прошлом и настоящем; отсутствие острых и хронических заболеваний; отрицание диет, приема контрацептивных, гормональных, противовоспалительных или антибактериальных препаратов. Исследование выполнено в соответствии с этическими стандартами национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. с ее последующими изменениями или сопоставимым нормам этики и одобрено локальным этическим комитетом ИЭГМ УрО РАН (протокол № 16 от 05.06.2022).

Таблица 1

Характеристика участников исследования [Characteristics of study participants]

Исследуемые группы	Количество	Возраст	Срок беременности, недель
Небеременные женщины	6	20.5 (20–27)	-
Беременные, I триместр	7	31 (25–32)	12 (10–12)
Беременные, III триместр	6	29 (25–32)	31 (30–32)

Примечание. Возраст и срок беременности представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей Me(Q1-Q3).

Венозную кровь получали из локтевой вены утром натощак в вакуумные пробирки с этилендиамин-тетрауксусной кислотой в качестве антикоагулянта после 8 ч. голодания. Собранную кровь делили на две равные части. Для анализа нейтрофилов низкой плотности выделяли фракцию мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МНПК). Для этого одну часть крови разводили средой RPMI 1640 в соотношении 1:1, наслаивали на фиколл (1.077 г/см3) и центрифугировали 40 мин про 400 g. МНПК собирали пипетированием с границы раздела фаз, затем ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), содержащим 2мМ ЭДТА и 0.1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), дважды отмывали центрифугированием по 5 мин. при 300 g. Для исследования общего пула гранулоцитов из второй части крови уда- ляли эритроциты с помощью лизирующего буфера (BioLegend, USA). Окрашивание моноклональными антителами проводили согласно инструкции производителя. Характеристика использованных антител представлена в табл. 2. Фенотип клеток анализировали на проточном цитометре «CytoFlex S» (BeckmanCoulter, США) с использованием программы «CytExpert 2.0» (Beckman Coulter, США). Анализировали не менее 100 000 событий в каждой пробе. Для уменьшения неспецифического связывания и адгезии клеток окрашивание проводили в ФСБ, содержащем 2мМ ЭДТА и 0.1% БСА, без использования консервантов. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции окна использовали соответствующие изотипические и негативные контроли. Стратегия гейтирования представлена на рис. 1.

Таблица 2

Характеристика антител [Antibodies characteristic]

Антитела Флюорохром Клон Изотип Производитель CD3 PE OKT3 Mouse/IgG2a, к BioLegend, USA CD16 Pacific blue™ 3G8 Mouse IgG1, κ BioLegend, USA CD107a APC H4A3 Mouse IgG1, κ BioLegend, USA GLUT-1 PE-Cy5.5 Polyclonal Rabbit IgG Biorbyt, Great Britain гранулоциты низкой плотиости во фракции моноііуклеаров периферической крови, выделенных методом седиментации в градиенте плотности 1,077 г/мл

общая фракция гранулоцитов после лигирования эритроцтов цельной крови

Рис. 1. Стратегия гейтирования гранулоцитов

[Granulocyte gating strategy]

Последовательно: определение региона живых клеток с использованием красителя Zombie UV ™ ; определение одиночных неслипшихся клеток (синглетов) по параметрам площади и высоты прямого светорассеивания (FSC-A/ FSC-H); выделение гранулоцитарного гейта по параметрам площади прямого (FSC-A) и высоты бокового (SSC-H) светорассеивания в периферической крови во фракции мононуклеарных клеток после выделения на градиенты фиколла (нейтрофилы низкой плотности у НБ и в III триместре (Б III) или в общей фракции гранулоцитов периферической крови после лизирования эритроцитов (общая фракция гранулоцитов у НБ и в III триместре (Б III)); определение CD3^- клеток в гейте гранулоцитов; выделение CD16^hi и CD16^int субпопуляций среди CD3^-CD16⁺ гранулоцитов; оценка экспрессии GLUT-1, CD107a среди CD16^hi- и CD16^int-клеток; определение включения флюоресцентного красителя MitoSpy ™ Green FM в CD16 hi - и CD16^int-клетки.

Представлены гистограммы одного репрезентативного эксперимента

Статистический анализ проводили с помощью программы Prism v.8.0.1 (Graphpad, США). Для проверки нормальности распределения использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Данные представлены в виде медианы (Me), нижних (LQ) и верхних квартилей (UQ). Достоверность различий между группами: небеременные – НБ (группа сравнения); беременные в I триместре (Б I); беременные в III триместре (Б III) определяли с использованием критерия Крускала-Уоллиса для множественных сравнений независимых переменных. Различия считали достоверными при p<0,05 .

Результаты и обсуждение

Среди гранулоцитов периферической крови доминирующей популяцией являются нейтрофилы (более 93%) [Кишкун, 2013]. При изучении гранулоцитов низкой плотности во фракции МНПК также показано, что эти клетки относятся к нейтрофильным гранулоцитам [Torell et al., 2023]. В проведенном исследовании показано, что у здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста процент гранулоцитов низкой плотности от фракции МНПК составляет 1.37% (0.96–3.72), а при беременности увеличивается: в I триместре – 5.83% (3.77–21.54; p<0,05 к НБ ), в III триместре – 3.21% (0.64–6.99) (рис. 1), что согласуется с работами других авторов [Torell et al., 2023]. У небеременных CD16^hi-нейтрофилы являются преобладающей субпопуляцией как в общем пуле гранулоцитов, так и среди клеток низкой плотности (рис. 2). Ранее подобные результаты для общей фракции нейтрофилов описаны и другими авторами для доноров обоих полов [Kamp et al., 2012; Medara et al., 2021; Martin et al., 2022]. Считается, что CD16^hi-нейтрофилы являются более зрелыми и проявляют бо_́льшую цитотоксичность по сравнению с CD16^int-нейтрофилами [Kamp et al., 2012]. В динамике беременности соотношение CD16^hi/CD16^int-клеток меняется аналогичным образом как среди общей фракции нейтрофилов, так и среди нейтрофилов низкой плотности: количество CD16^hi – снижается, а CD16^int-клеток увеличивается пропорционально сроку беременности (рис. 2). Нарастание пропорции CD16^int-клеток в периферической крови на фоне развития нейтрофильного лейкоцитоза, по-видимому, объясняется стимулирующим влиянием гормонов плаценты на миелопоэз и выходом менее зрелых форм нейтрофилов в периферическую кровь. Можно полагать, что системное угнетение цитотоксических реакций клеток адаптивного иммунитета, участвующих в антимикробной защите, при беременности компенсируется увеличением количества нейтрофилов, тогда как вопрос о причинах увеличения количества нейтрофилов низкой плотности при физиологической беременности остается открытым [Hassani et al., 2020]. Согласно данным литературы, нейтрофилы низкой плотности включают как незрелые формы, так и зрелые, которые приобретают характеристики данной популяции под влиянием активационных факторов [Hassani et al., 2020]. По-видимому, при беременности увеличение количества нейтрофилов низкой плотности в периферической крови обусловлено стимуляцией миелопоэза гормонами плаценты.

Цитотоксическую активность нейтрофилов оценивали по экспрессии молекулы CD107a (белок мембраны гранул), появление которой на поверхности клетки свидетельствует о ее дегрануляции и выбросе содержимого гранул во внеклеточное пространство. Анализ присутствия CD107a показал, что у небеременных женщин и в I триместре беременности количество CD107a-позитивных клеток не отличалось в субпопуляциях CD16hi- и CD16int-нейтрофилов как в общей фракции, так и среди нейтрофилов низкой плотности (рис. 3). В III триместре беременности процент CD16int-нейтрофилов, экспрессирующих CD107a, достоверно снижался по сравнению с небеременными как в общей фракции, так и среди нейтрофилов низкой плотности. Учитывая преобладание CD16int-нейтрофилов к концу беременности, можно сделать вывод о снижении цитотоксичности как общего пула нейтрофилов периферической крови, так и нейтрофилов низкой плотности в III триместре физиологической беременности. Таким образом, полученные результаты дополняют наше понимание механизмов снижения антимикробной резистентности организма матери, характерное для физиологической беременности.

Известно, что увеличение экспрессии GLUT-1 отражает усиление потребления глюкозы и активации метаболических процессов в клетке [Martin et al., 2022]. Краситель MitoSpy Green может избирательно накапливаться в матриксе митохондрий, где связывается белками [Cottet-Rousselle et al., 2011]. Накопление MitoSpy Green в клетке прямо пропорционально массе и объему митохондриального компартмента, что свидетельствует об усилении биогенеза энергетических органелл [Cottet-Rousselle et al., 2011]. Установлено, что у небеременных CD16hi- и CD16int-нейтрофилы как в общем пуле, так и среди клеток низкой плотности, не отличались по экспрессии GLUT-1 и способности накапливать MitoSpy Green, что свидетельствует об их сходной метаболической активности. В I триместре беременности экспрессия GLUT-1, масса и объем митохондрий достоверно не менялись в сравнении с небеременными женщинами. В III триместре масса и объем митохондрий достоверно увеличивались в CD16hi- и CD16int-нейтрофилах общего пула, тогда как среди гранулоцитов низкой плотности присутствовала подобная тенденция, но она не являлась достоверной (рис. 3В). Таким образом, можно заключить, что метаболическая активность нейтрофилов увеличивается к концу беременности, что, по-видимому, сопряжено с активацией в них синтетических процессов.

A

I 哀一济 а^т

ВИР

ОО

E CD16^hi

О CD16mt общей фракции гранулоцитов

司 CD 16 hi

I I CD 16 mt гранулоциты низкой плотности

Б

соотношение

員 CD16^hi □ CD16^int общей фракции гранулоцитов

員 CD16^hi □ CD16^int гранулоциты низкой плотности

Рис. 2. Процентное содержание (А) и соотношение (Б) CD16hi- и CD16int-нейтрофилов в общей фракции гранулоцитов и среди гранулоцитов низкой плотности у небеременных (НБ), беременных в I (Б I) и III триместрах (Б III).

Данные (А) представлены в виде медианы и межквартильного размаха, Me (Q1-Q3); процентное соотношение CD16hi/CD16int-клеток; значения «p» представлены по критерию Крускала-Уоллиса с апостериорным тестом Данна

[Percentage (A) and ratio (Б) of CD16hi- and CD16int-neutrophils in the total fraction of granulocytes and among low-density granulocytes in non-pregnant (НБ), pregnant women in I (Б I) and III trimesters (Б III).

Data (A) are presented in the form of median and interquartile range, Me (Q1-Q3); percentage ratio of CD16hi/CD16int cells; values of "p" are presented according to the Kruskal-Wallis criterion with the posteriori Dunn test]

Согласно данным литературы и нашим ранее проведенным исследованиям, гормоны, продуцируемые плацентой при беременности, оказывают мощные модулирующие эффекты на функциональную активность нейтрофилов периферической крови [Некрасова, Ширшев, 2013; Патурова и др., 2018]. Можно полагать, что выявленные нами функциональные особенности нейтрофилов при беременности также объясняются влиянием гормонов плаценты, поскольку нейтрофилы экспрессируют специфические рецепторы к гормонам беременности [Revelli, Mascobrio, Tesarik, 1998]. Учитывая способность нейтрофилов к инфильтрации тканей матки и участию в иммунном отторжении, модуляция их цитотоксической активности важна не только для обеспечения антимикробной резистентности, но и благополучного течения беременности. Полученные результаты раскрывают новые механизмы регуляции функциональной активности нейтрофилов при беременности.

А

ОО

Б

В

Es с=н UU 巴9Щ£

тьво^

20000-

10000-

一 ^и

EB CD1611'

О CD16int общей фракции ц>анулоцитов

ЕЗ CDi6hi

I I CDi6 mt гранулоциты низкой плотности

Рис. 3. Процент CD16hi- и CD16int-гранулоцитов, позитивных по экспрессии GLUT-1 (А), CD107a (Б), включению митохондриального зонда MitoSpy Green (В) в общей фракции гранулоцитов и среди гранулоцитов низкой плотности у небеременных (НБ), беременных в I (Б I) и III триместрах (Б III).

Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха, Me (Q1-Q3); (В) по оси ординат представлена медиана интенсивности флуоресценции (MFI, Median Fluorescence Intensity) в клетках, содержащих MitoSpy Green FM; значения «p» представлены по критерию Крускала-Уоллиса

[The percentage of CD16hi- and CD16int-granulocytes positive for the expression of GLUT-1 (A), CD107a (Б), the inclusion of MitoSpy Green mitochondrial probe (В) in the total fraction of granulocytes and among low-density granulocytes in non-pregnant (НБ), pregnant women in the I (Б I) and III trimesters (Б III)

Заключение

Таким образом, при физиологически протекающей беременности в периферической крови увеличивается количество гранулоцитов низкой плотности. В динамике беременности количество CD16int-нейтрофилов нарастает, а CD16hi-нейтрофилов снижается как в общей фракции гранулоцитов, так и среди клеток низкой плотности. Различия между нейтрофилами низкой плотности и общей фракции гранулоцитов выявлены по показателям метаболической активности в III триместре беременности. Также в III триместре беременности CD16int-нейтрофилы характеризуются меньшей цитотоксичностью как в общей фракции гранулоцитов, так и среди клеток низкой плотности по сравнению с CD16hi -нейтрофилами. Полученные результаты важны для понимания механизмов регуляции функций нейтрофилов при беременности и перспективны для направленной модуляции функций нейтрофилов периферической крови.