Ферментативная активность глютатион S-трансферазы Р и уровень экспрессии ее гена в опухолевых тканях щитовидной железы человека

Рак щитовидной железы (РЩЖ) является наиболее часто встречаемой злокачественной опухолью органов эндокринной системы [7, 15].

В последние годы отмечается рост заболеваемости данной патологией с различным прогнозом [18]. Основная проблема, возникающая перед

Праймеры для генов hGSTP, GAPDH и β-актина человека

Таблица

Ген	Последовательности нуклеотидных праймеров		Темпера-тура отжига (˚C)	Размер продуктов ПЦР (п.о).
β-актин	Прямой	5'-ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA - 3'	59	298
	Обратный	5' - CGG AAC CGC TCA TTG CC - 3'	59
GAPDH	Прямой	5'-GGGCGCCTGGTCACCA - 3'	62	350
	Обратный	5'-AACATGGGGGCATCAGCAGA - 3'	62
hGSTP	Прямой	5’-CATGCTGCTGGCAGATCA-3’	63	233
	Обратный	3’-CATTCACCATGTCCACCAG-3’	63

онкологами, заключается в сложности диагностики рака щитовидной железы на ранних стадиях и дифференцировке его от доброкачественных новообразований. Поэтому поиск молекулярных маркеров канцерогенеза щитовидной железы является актуальной задачей.

В настоящее время для своевременной диагностики и эффективного лечения злокачественных новообразований щитовидной железы (ЩЖ) активно ведется поиск новых молекулярных маркеров с использованием геномных и про-теиномных подходов [1, 11]. Так, показано, что соматические мутации в 918 кодоне протоонкогена RET, регистрируемые в 25–33 % случаев спорадической медуллярной карциномы, связаны с плохим прогнозом для этого типа рака [5]. Установлено также, что рецепторы тирозин киназ, такие как RET и TRK, также могут быть вовлечены в патогенез рака щитовидной железы, а мутации в онкогене BRAF – наиболее частые генетические изменения в папиллярной тиреоидной карциноме [6]. Такие исследования открывают широкие перспективы для применения таргетной терапии в лечении рака щитовидной железы [16]. Однако эффективность применения таких подходов пока еще трудно оценить. Поэтому актуальным является поиск новых информативных маркеров для дифференциальной диагностики различных типов опухолей щитовидной железы. Известно, что одним из патогенетических механизмов злокачественной трансформации тканей щитовидной железы является нарушение баланса тиреоидных гормонов [2]. Регуляция такого баланса осуществляется ферментативными системами детоксификации ксенобиотиков. Глутатион S-трансфераза класса Р (GSTP), осуществляющая метаболизм как экзогенных, так и эндогенных субстратов, является одним из таких ферментов. В настоящее время этот фермент рассматривается как важная мишень в диагностике и терапии рака [14]. Однако до сих пор не определена роль, которую играет GSTP в развитии рака щитовидной железы.

Целью настоящей работы является оценка ферментативной активности GSTP и уровня экспрессии ее гена в нормальных и опухолевых тканях щитовидной железы человека для возможного использования ее как маркера опухолей щитовидной железы.

Материал и методы

В работе использовали 49 образцов нормальной и опухолевой тканей щитовидной железы, удаленных в ходе хирургических вмешательств. Все пациенты были женского пола с диагнозом диффузно-узловой зоб (ДУЗ) или папиллярный рак щитовидной железы II стадии. Средний возраст больных составил 47 лет.

Проводимые исследования соответствовали этическим стандартам биоэтического комитета ГУ НИИ МББ СО РАМН, разработанным в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.03 № 266. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Определение уровня экспрессии гена hGSTP

Выделение суммарной РНК из тканей ЩЖ проводили гуанидин-фенольным методом. Уровень экспрессии определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР. Для проведения ОТ-ПЦР использовались праймеры, синтезированные в компании «Лаборатория Медиген», Новосибирск (таблица).

Измерение ферментативной активности GSTР

Ферментативная активность GSTР была измерена в цитозольной фракции замороженных тканей щитовидной железы с использованием этакриновой кислоты (ЕА) как субстрата. Реакция проводилась в калий-фосфатном буфере (0,1М КН2РО4, рН 6,5). К 300мкМ раствору ЕА добавлялся глютатион GSH (конечная концентрация 5мМ). В случае ферментативной реакции раствор также содержал 10–70 мкг белка. Через 4 мин к реакционной смеси добавляли двукратный объем хлористого метилена. Смесь тщательно перемешивали в течение 30 сек, после чего центрифугировали и отбирали водную фазу. В раствор вводился внутренний стандарт этилпарабен (6 мкг/мл). Анализ метаболитов проводился методом ВЭЖХ.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программ STATISTICA и Origin 7.0. Для оценки достоверности различий между выборками использовался t-критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для измерения активности hGSTP в опухолевых и нормальных тканях щитовидной железы человека было использовано 19 послеоперационных образцов ткани, из которых была выделена цитозольная фракция (рис. 1). Как видно из представленных диаграмм, изменение активности hGSTP в опухолевых тканях происходит по-разному у больных с диагнозом диффузно-узловой зоб и папиллярный рак щитовидной железы. В случае ДУЗ наблюдается в среднем 2–4-кратное повышение ферментативной активности у 7 больных из 10. При карциноме ЩЖ активность в опухолевой ткани относительно нормы понижается в 1,5–2 раза у 8 из 10 пациентов.

Для определения уровня экспрессии гена hGSTP в ткани щитовидной железы человека был использован метод полуколичественной мультиплексной ОТ-ПЦР. Экспрессия была измерена в образцах опухолевых и нормальных тканей у 30 больных. Для количественной оценки уровня экспрессии электрофореграмма была денситометрирована, результаты были представлены как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена

Рис. 1 . Ферментативная активность hGSTP в нормальной и опухолевой тканях ЩЖ больных с диагнозом: A) ДУЗ ЩЖ; Б) рак ЩЖ. Представлено среднее значение±SD. Каждый эксперимент проводился трижды

Рис. 2. Типичная картина разделения продуктов амплификации генов hGSTP и GAPDH. 1 – больной с диагнозом рак ЩЖ; 2, 3 – больные с диагнозом ДУЗ ЩЖ; Н – нетрансформированная ткань, О – опухолевая ткань hGSTP к интенсивности полосы гена GAPDH (рис. 2–4). У 12 больных с диагнозом ДУЗ наблюдалось повышение уровня экспрессии гена hGSTP в опухолевой ткани по сравнению с нормой (от 1,35 до 8 раз), у двух больных он не менялся, а у двух – понижался (в 1,5 и 2,5 раза). В случае рака щитовидной железы наблюдается понижение уровня экспрессии гена hGSTP в опухолевой ткани ЩЖ у 10 из 12 пациентов (в 1,5–3 раза). У двух больных экспрессия hGSTP повышается.

Полученные результаты выявили различный профиль экспрессии GSTP в тканях щитовидной железы. Известно, что это фермент второй фазы

Рис. 3. Относительный уровень мРНК hGSTP в нормальной и опухолевой тканях ЩЖ больных с диагнозом ДУЗ ЩЖ. Представлено среднее значение±SD. Каждый эксперимент проводился трижды

Рис. 4. Относительный уровень мРНК hGSTP в нормальной и опухолевой тканях ЩЖ больных с диагнозом рак ЩЖ. Представлено среднее значение±SD. Каждый эксперимент проводился трижды метаболизма ксенобиотиков, выполняющий в организме множество функций. Он участвует в процессах детоксификации чужеродных соединений, способен вызывать эффекты множественной лекарственной устойчивости, играет немаловажную роль в ответе организма на окси-дативный стресс. Однако наибольшее внимание этот фермент вызывает в связи с его участием в процессах канцерогенеза. Известно, что в некоторых опухолевых тканях уровень экспрессии гена hGSTP увеличен по сравнению с нормой. Особенно это ярко выражено при гепатоканце-рогенезе, где этот ген используется в качестве маркера для диагностики ранних стадий рака печени [19]. Подобные изменения экспрессии показаны для рака молочной железы, рака урогенитальной системы, рака легкого и простаты [3, 8, 12, 17]. Следует заметить, что до сих пор исследователи не уделяли должного внимания роли hGSTP в этиологии рака щитовидной железы. В связи с этим была исследована активность фермента и экспрессии гена hGSTP в опухолях щитовидной железы, как возможного маркера злокачественной трансформации.

Результаты показали, что у больных с диагнозом ДУЗ выявлено повышение ферментативной активности hGSTP в опухолевых тканях по сравнению с нормальными. При карциноме ЩЖ наблюдается обратная картина, то есть происходит снижение активности в опухолевых тканях по сравнению с нормой. Для того чтобы выявить, на каком молекулярном уровне происходит изменение ферментативной активности hGSTP, был измерен уровень мРНК ее гена. Полученные результаты отражают ту же тенденцию, что и данные по ферментативной активности: повышение уровня мРНК hGSTP в опухолевой ткани по сравнению с нормой при ДУЗ и понижение при карциноме ЩЖ. Таким образом, можно судить о том, что изменение ферментативной активности hGSTP при заболеваниях ЩЖ происходит на транскрипционном уровне. Тогда можно говорить о том, что в процессы трансформации тканей щитовидной железы вовлечены механизмы, регулирующие экспрессию гена hGSTP. Однако ответить на вопрос, является ли изменение в экспрессии гена причиной или следствием трансформации ЩЖ, представляется весьма проблематичным. Можно предположить, что тиреоидные гормоны и их рецепторы могут влиять на экспрессию hGSTP. На сегодняшний день в литературе нет данных о том, регулируется ли экспрессия hGSTP гормонами ЩЖ. Тем не менее известно, что промоторная область GSTP включает в себя элемент, структурно похожий на сайт, отвечающий за связь с рецептором тиреоидных гормонов [13], из чего следует, что такая возможность существует.

Другим возможным способом регуляции экспрессии гена GSTP в опухолях ЩЖ может выступать эстроген-зависимый путь. Известно, что нарушение функций ЩЖ гораздо чаще встречается у женщин в возрасте 45–60 лет [9]. Было показано, что эстрогены способны вызывать пролиферацию культуры клеток ЩЖ человека, воздействуя на циклин D [10]. Известно также, что уровень мРНК эстрогеновых рецепторов изменяется в трансформированных тканях ЩЖ по сравнению с нормой. Так, например, уровень мРНК ERα повышается при фолликулярной аденоме и понижается при различных карциномах. Уровень мРНК Erβ, напротив, понижается при аденоме и повышается при карциномах [4]. Литературные данные о регуляции экспрессии hGSTP эстрогеновыми рецепторами остаются противоречивыми.

Таким образом, в нашей работе первые показано, что в тканях ЩЖ человека регистрируется заметная активность GSTP, которая зависит от степени трансформации ткани. В большинстве случаев (60 %) у больных с диагнозом нетоксический зоб наблюдается 2–8-кратное увеличение активности GSTP в опухолевой ткани по сравнению с нормальной. У 90 % онкологических больных наблюдается противоположная картина: активность фермента в опухоли в 1,5–3 раза ниже, чем в норме. Такое перераспределение активности GSTP и экспрессии ее гена в доброкачественных и злокачественных тканях ЩЖ может служить основой для дальнейшей разработки метода дифференциальной диагностики этих новообразований.