Ферментативная активность и эмиссия закиси азота из дерново-подзолистой супесчаной почвы с биоуглем

Воздействие различных агроприемов на почвенный покров (обработки, внесения удобрений, мелиорантов) и собственно сельскохозяйственных культур вызывает изменение микробиологической и, соответственно, ферментативной активности (1). От интенсивности и направленности этих биологических процессов, а также от комплексного эффекта почвенных и климатических факторов зависит эмиссия закиси азота (N2O), которая существенно модифицирует климат (2).

Установлено, что внесение биоугля в почву изменяет физические и химические условия, которые влияют на деятельность микроорганизмов, контролирующих потоки C и N в биосфере (3-8). Полученные достоверные данные об эффективности снижения эмиссии N2O из дерново-подзолистой супесчаной почвы с помощью биоугля указывают на возможность его применения на легких по гранулометрическому составу почвах, но для обоснования этого приема необходимо четко представлять механизмы происходящих процессов, в частности свойства естественного ферментативного комплекса. Особое внимание, по нашему мнению, следует уделить катализирующему эффекту гидролаз и оксидоредуктаз (9, 10). Среди названных классов ферментов выделяются уреазы (КФ 3.5.1.5), каталазы 464

(КФ 1.11.1.6), пероксидазы (КФ 1.11.1.7) и полифенолоксидазы (КФ 1.10.3.1). Перечисленные ферменты обладают высокой чувствительностью к различным воздействиям и выполняют важные функции в трансформации органического вещества, от которой зависит цикл N (11-13). С уреазной активностью связана аммонификация мочевины и переход азота в доступную для растений форму. Каталаза относится к окислительновосстановительным ферментам. Полифенолоксидаза и пероксидаза участвуют в многоступенчатых процессах разложения и синтеза органических соединений ароматического ряда, влияя на образование гумуса (14). Биологическая диагностика почв по ферментативной активности позволит определить характер и степень антропогенного воздействия на почвенный покров и раскрыть механизмы взаимодействия внесенного продукта с почвой.

Нами впервые проведен сопряженный анализ влияния биоугля на процессы формирования N2O в почве и активность ферментов, принимающих участие в трансформации углерод- и азотсодержащих веществ, и показана существенная роль окислительно-восстановительных ферментов в выявлении механизмов воздействия биоугля на почву.

Цель выполненных модельных опытов заключалась в оценке влияния биоугля на эмиссию N2O и ферментативную активность дерновоподзолистой супесчаной почвы.

Методика . Образцы дерново-подзолистой супесчаной почвы отбирали из пахотного горизонта (0-28 см) до начала полевого сезона 2016 года (биополигон Меньковского филиала АФИ, Гатчинский р-н, Ленинградская обл.), высушивали при 22 °С и просеивали через сито (ячейка 2 мм). Биоуголь был получен быстрым бескислородным пиролизом древесины мягких лиственных пород деревьев (ольха, береза, осина) при температуре 550 °С. В почву вносили фракцию биоугля с диаметром частиц < 1 см.

По 300 г просеянной почвы, увлажненной до 23 % от наименьшей влагоемкости (НВ), помещали в вегетационные сосуды объемом 500 мл с герметичными крышками, в центре которых были установлены резиновые пробки для отбора проб воздуха при помощи шприца. В течение первых 7 сут проводили предварительную инкубацию для достижения равновесного состояния микробного сообщества и увлажненности. Затем в почву внесли биоуголь (вариант Б) в дозе 0,42 г/сосуд, что соответствовало 10 т биоугля на 1 га, нитроаммофоску N₁ 6 P₁ 6 K₁ 6 (вариант N₉₀) в дозе 0,23 г/сосуд (90 кг N/га) или смесь биоугля и нитроаммофоски (вариант N₉₀ + Б). Полученные субстраты равномерно перемешали. Контролем (К) служила почва без биоугля и удобрения, которую также предварительно инкубировали, затем перемешали. Образцы уплотняли до значения 1,2 г/см³, что соответствовало равновесной плотности сложения изучаемой почвы в полевых условиях. Повторность опыта 9-кратная, распределение образцов рендомизи-рованное. Сосуды помещали в биологический шкаф на инкубацию при постоянной температуре воздуха 28 °С. На протяжении всего эксперимента сосуды с почвой оставляли открытыми, закрывая только на время отбора воздуха для анализа на N₂O (на 30 мин). Влажность почвы поддерживали, ориентируясь на массу сосудов при изначально заданной влажности, почву увлажняли после отбора воздуха.

Отбор проб воздуха проводили через день на протяжении первых 2 нед после внесения биоугля и минерального удобрения, далее 2-3 раза в неделю, после 60-х сут — один раз в неделю. Общая продолжительность эксперимента — 90 сут.

Концентрацию N2O в образцах воздуха измеряли на газовом хроматографе Fractovap 4130 («Carlo Erba Strumentazione SpA», Италия), осна- щенном детектором электронного захвата.

Динамику ферментативной активности (отбор проб через каждые 10 сут) изучали с использованием стандартных методик (13, 14): активность каталазы определяли перманганатометрией по Джонсону и Темпле, уреазы — фотоколориметрически с реактивом Несслера по количеству окрашенных комплексов аммиака, образующегося при гидролизе мочевины; пероксидазы и полифенолоксидазы — фотоколориметрически по Галстяну (1968).

Для обработки данных использовали пакеты программ Microsoft Excel и Statistics 8.0 («StatSoft Inc.», США). Статистический анализ включал вычисления значений средних ( M ), стандартных отклонений (±SD) и коэффициентов линейной корреляции ( r ) при p ≤ 0,05. Достоверность различий средних оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и метода апостериорного анализа по критерию достоверно значимой разности Тьюки (Tukey's honestly significant difference test) при p ≤ 0,05 (15).

Результаты . Основные агрохимические характеристики почвы при отборе: C орг. — 2,4 %; N общ. — 0,17 %; N-NO 3 — 11,2 мг/кг; N-NH 4 — 4,5 мг/кг; подвижный P₂O₅ — 299 мг/кг; подвижный K₂O — 97 мг/кг; pH_KCl 5,3; характеристика биоугля: С_общ. — 87,4 %; N_общ. — 0,038 %, H — 28 мг/г, pH 7,6.

Расчет кумулятивных потоков N2O за 80 сут показал достоверные (p < 0,05) различия между всеми вариантами опыта (рис. 1). Внесение в исследуемую почву N16P16K16 (N90) увеличило кумулятивный поток N2O в 2 раза по сравнению с контролем, биоугля — снизило кумулятивную эмиссию в 1,4 раза как по сравнению с контролем, так и относительно показа- теля для почвы с минеральным удобрением.

400-г

От------------------------1------------------------1------------------------1------------------------1--------

4 июня 24 июня 14 июля 3 августа 23 августа

Дата

Рис. 1. Кумулятивная эмиссия закиси азота в образцах дерново-подзолистой почвы в контроле (1) , при внесении биоуголя (2) , удобрения (нитроаммофоска) (3) и биоугля в сочетании с удобрением (4). Приведены средние ( M ) и стандартные отклонения (±SD) (лабораторный опыт).

Полученные данные о способности биоугля снижать эмиссию N2O согласуются с результатами других ученых, показавших, что с переводом углеродных пулов биомассы при пиролизе в ароматическую форму, труднодоступную для почвенных микроорганизмов, существенно снижается скорость образования N2O. Это связано с изменением физических и химических условий жизнедеятельности почвенных микроорганизмов, отвечающих за образование парниковых га зов. В некоторых работах показано (4-7), что эмиссия N2O существенно снижалась после внесения биоугля в почву даже при доле водонасыщенных пор 78 %, то есть в анаэробных условиях. Улучшение водно-воздушного режима почвы и ослабление процесса денитрификации приводило к уменьшению кумулятивной эмиссии N2O из почв.

Ранее также установлено, что биоуголь способствовал повышению активности, группового и функционального разнообразия в почвенном микробном сообществе (8, 16), стимулировал развитие почвенных плесневых грибов и аэробных целлюлозоразлагающих бактерий, активно потреб-466

ляющих азот и подавляющих рост азотобактера (17, 18).

При внесении в почву органических, минеральных удобрений и мелиорантов возможно изменение активности уреазы, определяющей важные этапы превращения азотсодержащих веществ в почве. Результаты эксперимента показали, что по оценке степени обогащенности почв ферментами (19) исследуемые варианты почвы в эксперименте характеризовались как бедные по уреазной активности (от 3 до 10 мг N-NH4/10 г почвы за 1 сут). Изучение динамики накопления этого фермента показало усиление активности в течение 30 сут инкубации с дальнейшим снижением к концу эксперимента. Внесение нитроаммофоски достоверно (p < 0,05) увеличило уреазную активность (в среднем в 1,6 раза) по сравнению с контролем, тогда как внесение биоугля не существенно снижало уреазную активность по сравнению как с контролем, так и с показателем в варианте N90 (рис. 2). Коэффициенты корреляции (r) между эмиссией N2O и уреазной активностью были невысокими и составили (при p < 0,05) 0,51 (К), 0,38 (Б), 0,62 (N90) и 0,67 (N90 + Б). В исследованиях H. Jin (20) установлено, что при внесении в почву биоугля может наблюдаться снижение уреазной активности, которое связано с изменением pH среды (в своем большинстве различные виды биоугля имеют нейтральный pH) и высокой адсорб- ционной способностью биоугля.

Фермент

В нашем опыте каталазная активность

Рис. 2. Ферментативная активность дерново-подзолистой почвы в контроле (а) , при внесении биоуголя (б) , удобрения (нитроаммофоска) (в) и биоугля в сочетании с удобрением (г): У — уреаза, мг N-NH 4 /10 г почвы за 1 сут; К — каталаза, мг KMnO 4 /г почвы за 20 мин; П — перокида-за, мг пурпурогаллина в 100 г почвы: ПФО — полифенолокси-даза, мг пурпурогаллина в 100 г почвы. Приведены средние ( M ) и стандартные отклонения (±SD) (лабораторный опыт).

снижалась от начала до окончания наблюдения во всех исследованных вариантах. Подобную тенденцию отмечали и в других работах, например М.А. Размахина (21) и Е.В. Даденко (22) сообщали, что в лабораторных условиях каталазная активность имела общую тенденцию уменьшения к концу эксперимента и зависела от воздушного режима, влажности почв и плотности сложения.

По обогащенности ферментами (19) почвы в вариантах эксперимента характеризовались как очень бедные по каталазной активности (< 1 мг KMnO₄/1 г за 20 мин). В контроле содержание этого фермента было минимальным и варьировало от 0,89 до 0,23 мг KMnO₄/г за 20 мин. Внесение N₉₀ достоверно (p < 0,001) усилило каталазную активность в среднем в 1,4 раза, так же как внесение биоугля (p < 0,05) увеличило активность фермента соответственно в 1,3 и 1,2 раза по сравнению с контролем и показателем в почве с нитроаммофоской (см. рис. 2). Коэффициенты корреляции между эмиссией N₂O и каталазной активностью были высокими (р < 0,05) и составили 0,89 (К), 0,85 (Б), 0,84 (N 90 ) и 0,87 (N 90 + Б).

Результаты исследований показали, что активность пероксидазы была в среднем в 50 раз выше, чем активность полифенолоксидазы, а внесение биоугля существенно (p < 0,05) увеличило активность этих ферментов, по сравнению с таковой в вариантах без биоугля. Скорее всего, это 467

связано с особыми условиями аэрации, которые обеспечивались благодаря пористой структуре биоугля (в отличие от образцов, где он отсутствовал) (22-24). Однако коэффициенты корреляции между эмиссией N₂O и пероксидазной активностью, а также полифенолоксидазной активностью были низкими и составили (при p < 0,05) соответственно -0,42 и 0,45 (К), -0,47 и 0,59 (Б), -0,39 и 0,46 (N 90 ), -0,47 и 0,41 (N 90 + Б).

Соотношение полифенолоксидазной к пероксидазной активности принято считать условным коэффициентом гумификации (Кгум.) органического вещества, который в определенной мере может характеризовать направленность (минерализация или иммобилизация) образования специфического гумусового вещества в почве (22, 25). Величина Кгум., рассчитанная по соотношению активности этих ферментов, оказалась < 1 во всех вариантах опыта, что свидетельствовало о преобладании процессов минерализации гумусовых веществ над их синтезом. Внесение биоугля способствовало несущественному усилению минерализации — в среднем в 1,1 раза по сравнению с контролем и почвой с минеральными удобрениями.

Таким образом, при внесении биоугля (10 т/га) в дерново-подзолистую супесчаную почву эмиссия N₂O была достоверно (p < 0,05) ниже (в среднем в 1,4 раза), чем в контроле и в почве с минеральным удобрением. При этом уреазная активность снижалась в среднем в 1,2 раза (без существенных различий с вариантами без биоугля). Активность изучаемых оксидоредуктаз достоверно (p < 0,05) возрастала: каталазы — в 1,3 раза, пероксидазы и полифенолоксидазы — в 1,2 раза, что связано с изменением физических свойств почвы при внесении биоугля (в первую очередь аэрации) и отражает изменения окислительно-восстановительных условий. Между эмиссией N₂O и каталазной активностью установлена высокая положительная корреляция ( r = 0,85 и r = 0,87 соответственно для биоугля и сочетания биоугля с нитроаммофоской). Соотношение активности полифе-нолоксидазы к пероксидазе свидетельствовало об усилении минерализации гумусовых веществ в присутствии биоугля. Все изученные ферменты, кроме уреазы, оказались чувствительными биоиндикаторами состояния почвы и могут использоваться для экологической оценки систем землепользования.