Ферментативная активность и стабилизация органического углерода в агродерново-подзолистой почве

Ферментативная активность почв отражает активность почвенной биоты и ее способность к различным биохимическим превращениям (1-3). В процессах гумусообразования важное участие принимают почвенные внеклеточные гидролитические и окислительно-восстановительные ферменты. К гидролитическим относят, в частности, протеазы, целлюлазы, амилазы, липазы, к окислительно-восстановительным — полифенолокси-дазы, пероксидазы, дегидрогеназы. Полифенолоксидазы (ПФО) и перокси- дазы (ПО) относятся к классу оксидоредуктаз. Они присутствуют в почве в свободном состоянии, а также могут быть связаны в органо-минеральноферментные комплексы (4, 5). Они поступают в почву в виде прижизненных выделений корней растений и микроорганизмов (бактерий, актино-мицет, грибов) (6, 7). ПФО участвуют в биосинтезе гумусовых кислот за счет катализа реакций окислительной полимеризации ароматических соединений в присутствии кислорода (8). Пероксидазы — ферменты, катализирующие окисление полифенолов и некоторых ароматических аминов с участием кислорода перекиси водорода (9, 10). Активность ПФО и ПО может служить индикаторам интенсивности процессов гумусообразования (11) и в основном коррелирует с абиотическими факторами, в меньшей степени на нее влияет видовой состав и биомасса почвенных грибов (12).

Скорость накопления почвенного гумуса зависит от активности ПФО и ПО (13), поскольку образование и деструкция гумусовых веществ происходят одновременно. С одной стороны, почвенное органическое вещество может влиять на активность внеклеточных ферментов, выделяемых микроорганизмами и корнями растений, обеспечивая энергию и субстрат для секреции ферментов (14), с другой — повышенная активность оксидаз усиливает разложение органического вещества, что негативно сказывается на его запасе (11).

Установлена тесная связь между динамикой содержания органического вещества в почве и активностью указанных ферментов (15, 16). Состояние, в котором находится органическое вещество почвы, определяет количество выбросов СО 2 в атмосферу, что, в свою очередь, влияет на изменение климата. Так, почвенное органическое вещество закрепляется, образуя органо-минеральные комплексы с глинистыми минералами (17, 18). Кроме того, содержание почвенного углерода положительно коррелирует с содержанием илистых частиц в минеральной почве (19).

Влажность и температура влияют на сезонные изменения содержания органического вещества в почве и ее илистой фракции. В ряде работ (20-23) установлена тесная корреляция между среднегодовым количеством осадков, растительностью и содержанием органического углерода в почве. Поскольку по мере увеличения количества и частоты осадков чистая первичная продукция и поступление растительных остатков в почву возрастают, это приводит к большему накоплению в ней органического углерода. Однако на взаимосвязь между этими параметрами влияет рельеф и качество растительного опада (24).

Водный режим почвы оказывает существенное воздействие на почвенные процессы, установлена прямая зависимость между выпадающими осадками, влажностью почвы и ее ферментативной активностью (25). С увеличением запаса влаги и понижением температуры почвы наблюдается повышение активности гидролитических ферментов инвертазы, уреазы, фосфатазы, АТФазы, а также оксидоредуктаз, в частности дегидрогеназы. Активность полифенолоксидаз и пероксидаз связана с рН почвы, наличием тяжелых металлов, среднегодовым количеством осадков и среднегодовой температурой и, как следствие этого, — с температурой и влажностью почвы, а также с типом почвы и растительности (26-28). В работе S. Liu с соавт. (29) показана положительная корреляция между содержанием воды в почве и активностью ПФО. Кроме того, было обнаружено, что доступность кислорода ограничивает активность полифенолоксидазы в субстрате (30).

В настоящей работе впервые установлено влияние активности ПФО, ПО на аккумуляцию органического углерода в агродерново-подзолистой почве и ее илистой фракции.

Цель работы — изучение сезонной динамики ферментативной активности полифенолоксидаз и пероксидаз и ее влияния на стабилизацию органического углерода в агродерново-подзолистой почве.

Методика. Полевые исследования проводили в вегетационные периоды 2020-2021 годов на территории экспериментальной опытной станции ФГБНУ АФИ (п. Меньково, Ленинградская обл., Гатчинский р-н) на участке агродерново-подзолистой почвы без внесения минеральных удобрений.

Делянка 2½2 м в 2020-2021 годах была занята чистым паром, в 2019 году на ней выращивали вико-овсяную смесь ( Vicia sativa L., Avena sativa L.). Содержание физической глины в агродерново-подзолистой почве составляло 19 %, илистой фракции — 4,8 %. Агрохимические показатели на начало опыта были следующими: С орг. = 2,92 %, N общ. = 0,28 %, N-NO 3 = 22,3 мг/кг почвы, N-NH 4 = 6,7 мг/кг почвы; подвижный P 2 O 5 = 994 мг/кг почвы, подвижный K 2 O = 542 мг/кг почвы (метод Кирсанова), рН KCl 6,4. Отбор почвенных образцов при помощи почвенного бура Эндельмана из слоя гумусового горизонта 0-10 см проводили методом конверта каждый месяц с мая по август.

Содержание общего органического углерода (С орг. ) и углерода, ассоциированного с илистой фракцией (С ил. ), определяли методом Тюрина (31). Для выделения илистой фракции почвы (< 1 мкм) в образец почвы массой 200 г, пропущенный через сито с диаметром ячеек 1 мм, добавляли дистиллированную воду. Полученную смесь диспергировали в течение 30 мин при помощи ультразвуковой установки BRANSON 450 («Branson Ultrasonics Corporation», США) при мощности 315 Вт (70 % от максимальной). Затем образец переносили в сосуд и подвергали седиментации. Для осаждения илистой фракции почвы использовали центрифугу JANETZKI S70 («Heinz Janetzki», Польша) (6000 об/мин, время центрифугирования 15 мин). Полученный ил высушивали на воздухе при комнатной температуре (32).

Влажность почвы определяли термостатно-весовым методом, температуру — с использованием электронных датчиков iButton DS 1921 («Dallas Semiconductor», США), установленных на глубине 10 см. Процесс накопления углерода в почве оценивали с использованием коэффициента обогащения углеродом илистой фракции почвы (E soc ) (33):

E soc = C ф. /С орг. , где С ф. — содержание углерода фракции, % от массы фракции, С орг — содержание общего органического углерода, % от массы почвы.

Активность пероксидаз и полифенолоксидаз изучали фотоколори-метрическим методом по Галстяну при X = 440 и X = 590 нм (34). При определении активности оксидаз к навеске почвы массой 1 г приливали 0,5 мл толуола, 100 мл Н 2 О, встряхивали в течение 20 мин и фильтровали. Расставляли два ряда колб. Для определения активности ПФО к 10 мл фильтрата приливали 5 мл 1 % раствора пирогаллола, для оценки активности ПО к 10 мл фильтрата приливали 5 мл 1 % раствора пирогаллола и 1 мл 0,5 % Н 2 О 2 . Все колбы оставляли в термостате (ОАО «Смоленское СКТБ СПУ», Россия) при 37 °С на 2 ч, затем — при комнатной температуре на 14 ч. Утром проводили колориметрию на спектрофотометре ПЭ-3000УФ (ООО «ПромЭкоЛаб», Россия) с синим светофильтром. В контрольном образце смешивали 10 мл воды и 5 мл пирогаллола. Активность ферментов выражали в мг пурпургаллина. Для получения калибровочной кривой проводили серию последовательных разбавлений раствора K 2 Cr 2 O 7 . Окрашивание 0,75 г реактива, растворенного в 1 л 0,5 н HCl, соответствовала содержанию в 1 мл раствора 0,1 мг пурпургаллина. Аналитическая повторность 3-кратная.

Для количественной характеристики процесса гумификации используют коэффициентом гумификации, который равен доле углерода органических остатков (%), трансформировавшихся в гумусовые вещества (35). Для оценки интенсивности процессов гумусообразования А.И. Чундерова (36) предложила использовать коэффициент гумификации (К гум. ), который представляет собой отношение активности полифенолоксидаз (ПФО) к активности пероксидаз (ПО): К гум. = ПФО/ПО. Этот коэффициент в определенной степени может характеризовать направленность гумификации. Если К гум. > 1, то в почве преобладают процессы синтеза гумуса, если К гум. < 1, то превалируют процессы распада гумусовых веществ.

Статистическую обработку данных осуществляли при помощи пакета программ Microsoft Excel. Вычисляли средние значения ( M ), стандартные отклонения (±SD) и коэффициенты корреляции Пирсона. Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа при уровне значимости p < 0,05.

Результаты. По данным Меньковской метеостанции (Ленинградская обл., Гатчинский р-н), средняя температура воздуха за вегетационные периоды с мая по сентябрь 2020 и 2021 годов составила соответственно + 14,5 и +15,7 °С, количество выпавших осадков — 517 и 536 мм (табл. 1).

1. Погодные условия вегетационных периодов 2020-2021 годов, по данным

Меньковской метеостанции (Ленинградская обл., Гатчинский р-н)

Год, месяц

Показатель

V    VI VII VIII IX   V   VI VII VIIIIX

Среднесуточная температура, °С +8,8 +18,1  +16,5 +16,4  +12,8  +10,8 +19,7 +21,1  +15,4+12,4

Количество осадков, мм

80,0   38,9   167,7  185,4    45,2   245,5   29,0   36,2   190,456,5

Рис. 1. Сезонная динамика полифенолоксидазной (1) и пероксидазной (2) активности агродер-ново-подзолистой почвы на территории экспериментальной опытной станции ФГБНУ АФИ за два года ( n = 3, M ±SD; п. Меньково, Ленинградская обл., Гатчинский р-н) .

За два года наблюдений активность ПФО и ПО достигла наибольших значений в 2021 году (рис. 1). Средняя активность ПФО за период наблюдений в 2020 году составила 1,09 мг пурпургаллинат ^{- 1} •ч ^{- 1}, в 2021 году — 5,58 мг пурпургаллинат ^{- 1} •ч ^{- 1}. Средняя активность ПО в 2020 году составила 0,63 мг пурпургаллинат ^{- 1} •ч ^{- 1}, в 2021 году — 2,14 мг пурпургал-линат ^{- 1} •ч ^{- 1}. Самую высокую активность ПФО за два сезона наблюдали в начале июня, ПО — в начале июня и середине июля (см. рис. 1). В этот период складывались наиболее благоприятные условия для микробного сообщества, а именно соотношение температуры и влажности почвы.

Совокупным итогом деятельности микроорганизмов и влияния абиотических факторов (температуры почвы, влажности почвы, рН среды) становится процесс гумусообразования. По мнению R.I. Sinsabaugh (15), ок- сиды и гидроксиды Mn, Fe и Al в почве создают акцепторы электронов, которые катализируют образование реакционноспособных частиц из фенолов. Эти промежуточные соединения конденсируются с другими фенолами или аминокислотами с образованием гуминовых соединений. Илистые и глинистые фракции почвы катализируют реакции декарбоксилирования и дезаминирования, способствующие минерализации органического вещества, а также реакции конденсации, приводящие к образованию гуминовых кислот.

Рис. 2. Значения коэффициента гумификации (К гум. ) агро-дерново-подзолистой супесчаной почвы на территории экспериментальной опытной станции ФГБНУ АФИ ( n = 3, M ±SD; п. Меньково, Ленинградская обл., Гатчинский р-н) .

Величина К гум. на протяжении 2 лет не опускалась ниже 1, что свидетельствовало о преобладании процессов синтеза гумусовых веществ над минерализацией органических веществ (рис. 2). В 2020 году в среднем за сезон К гум. составил 1,76, в 2021 году — 2,63, что указывало на более интенсивное образования гумусовых веществ в вегетационный период 2021

года. Вероятно, это было связано, с одной стороны, с благоприятными почвенно-климатическими условиями, способствующими усилению активности ПФО и ПО. С другой стороны, в 2019 году на делянке выращивали вико-овсяную смесь, которая оставила после себя много пожнивно-корневых остатков, послуживших дополнительным источником органических веществ для питания почвенных микроорганизмов и способствовавших усилению активности оксидаз во второй год эксперимента. Мелкие фрагменты органических веществ, вероятно, легче образовывали комплексы с минера- лами почвы.

Молекулы гуматов и фульватов из-за большого размера и особой формы не проникают в межслоевые промежутки глинистых минералов, а фиксируются на поверхности за счет адгезии и когезии. В межслоевые промежутки могут проникать лишь низкомолекулярные продукты разложения органических веществ (37). В целом, фиксации гуматов и фульватов способствуют химический состав поверхностных слоев коллоидов, в частности количество железа и алюминия, дисперсность минералов, наличие несиликатных полуторных окислов. Адсорбция органических молекул глинистыми минералами представляет собой сложный процесс, в котором могут иметь место различные взаимодействия — Н-связывающие, ионно-дипольные и ван-дер-ваальсововы (38).

Органическое соединение также может образовывать комплексы с противоионами глинистого минерала или подвергаться ионному обмену. В исследуемой почве и ее илистой фракции содержались следующие глинистые минералы: каолинит, хлорит, гидрослюды (слюда с дефицитом межслоевых катионов, слюда диоктаэдрическая, слюда триоктаэдрическая) (39).

Содержание ПФО в почве в опыте увеличилось более значительно, чем ПО, что привело к увеличению К гум. в 2021 году по сравнению с 2020 годом. По данным Е.Я. Рижия с соавт. (40), в почве делянок, на которых в 2020 году выращивали люпин белый ( Lupinus albus L.), активность ПФО составляла 1,463 мг пурпургаллина•г ^{- 1}•ч ^{- 1}, ПО — 2,074 мг пурпургалли-на•г ^{- 1}•ч ^{- 1}. В почве, используемой как чистый пар, активность оксидаз в

2020 году оказалась существенно ниже: ПФО — в 1,3 раза, ПО — в 3,3 раза. Следовательно, наличие растений и их вид оказывают влияние на биологическую активность почв, что согласуется с данными других исследователей (41, 42).

Большое количество корневых и приземных остатков, которое образовывал люпин белый в течение вегетационного периода, способствовало усилению ферментативной активности. Так, по данным Е.И. Золкиной (43), в условиях дерново-подзолистой супесчаной почвы надземные (стерня и опад) и подземные растительные остатки (корни) люпина составляют 3746,7 ц/га сухого вещества. Вероятно, чистый пар отличается малой численностью таких групп микроорганизмов, как целлюлозоразрушающие, мик-ромицеты, актиномицеты, которые используют органические и минеральные формы азота, что обусловлено отсутствием поступления свежего органического вещества (44, 45). В свою очередь, сидеральный пар (в нашем случае вико-овсяная смесь — предшественник чистого пара) усиливает развитие этих групп микроорганизмов, особенно бактерий. Так, количество аммонифицирующих бактерий при использовании сидерального пара возрастает в 3,3 раза по сравнению с чистым паром (46). Этим фактом можно объяснить снижение оксидазной активности в почве под чистым паром по сравнению с активностью почвы, занятой сидератом.

Корреляционный анализ выявил достоверную сильную обратную связь между активностью ПФО и температурой почвы за 2 года наблюдений ( r = -0,73 и r = -0,80, p < 0,05) и достоверную сильную положительную связь в 2021 году между активностью ПО и влажностью почвы ( r = 0,99, p < 0,05). В остальных случаях взаимосвязь между активностью изученных оксидаз, температурой почвы и ее влажностью была слабой и носила недостоверный характер. В 2020 году связь С орг. и С ил. с ПФО носила положительный характер (достоверный для С орг — r = 0,48, p < 0,05 и недостоверный для С ил. — r = 0,38), в 2021 году достоверные положительные взаимосвязи были зафиксированы для ПФО и С орг. ( r = 0,84, p < 0,05), ПО и С ил. ( r = 0,90, p < 0,05). Тесная положительная корреляция активности ПФО в дерново-подзолистой почве с содержанием С орг. ( r = 0,99, p < 0,05) отмечена в работе I.N. Kurganova с соавт. (47). В то же время активность ферментов не может быть простым отражением количества почвенного органического вещества, поскольку в пахотных почвах, где наблюдается низкое поступление углерода, разложение органического вещества посредством ферментов может угнетаться из-за нехватки энергии и субстрата (14).

Рис. 3. Сезонная динамика содержания общего органического углерода (С орг. ) в агродерново-подзолистой супесчаной почве на территории экспериментальной опытной станции ФГБНУ АФИ за два года ( n = 3, M ±SD; п. Меньково, Ленинградская обл., Гатчинский р-н) .

В 2020 году наиболь- шее количество общего органического углерода в пахотном горизонте обнаружили в начале июня — 29,54 г С/кг почвы, а почвенные пробы, отобранные в конце августа, характеризовались минимальными значениями Сорг. (25,16 С/кг почвы) (p < 0,70) (рис. 3). В середине июня зафиксировали падение содержания Сорг. на 0,37 % по сравнению со значениями в начале месяца, что, вероят- но, связано с увеличением минерализационных потерь органического углерода. В этот период температура почвы составляла 21,5 °С, весовая влажность — 8,2 %.

Известно, что наиболее полный распад органического вещества наблюдается при температуре почвы 20-25 °С и влажности 60-80 % от полной влагоемкости (48). Однако температура почвы в большей степени влияет на минерализационные потери, чем влажность. Так, по данным А.С. Тулиной с соавт. (49), потенциальная минерализация органического вещества для серой лесной почвы, чернозема и темно-каштановой почвы в течение 150-суточного опыта на 63 % зависела от температуры и лишь на 8 % — от влажности. Возможно, в нашем случае, кроме наличия оптимальной темпе- ратуры для минерализации, также произошло резкое снижение содержания углерода микробной массы в условиях отсутствия свежего органического вещества и низкой влажности, что отразилось на содержании Сорг.. В работе Э.О. Чимитдоржиевой с соавт. (50) также отмечалось снижение накопления углерода микробной массы в черноземе от 0,62 до 0,52, в каштановой почве — от 0,39 до 0,31 мг С/г почвы при дефиците влаги в сочетании с высокой температурой воздуха и почвы.

В 2021 году были зафиксированы несколько меньшие величины по- казателя, вероятно, из-за отсутствия поступления свежих органических остатков и потребления лабильной части почвенного углерода (легкой фракции, водорастворимого органического вещества) почвенными микроорганизмами. В почве под чистым паром источником углерода для микро- организмов становятся главным образом трудноразлагаемые растительные и микробные остатки, которые распадаются в результате природных воз- действий и применения почвообрабатывающих орудий (51). В целом в 2021 году сохранялась практически такая же тенденция в динамике Сорг., как и в 2020 году: наблюдались статистически значимые (p < 0,05) различия между величинами Сорг. в течение всего вегетационного периода.

Рис. 4. Сезонная динамика содержания углерода, ассоциированного с илом (С ил. ), в агродерново-подзолистой супесчаной почве на территории экспериментальной опытной станции ФГБНУ АФИ за два года ( n = 3, M ±SD; п. Меньково, Ленинградская обл., Гатчинский р-н) .

Максимальное содержание общего органического углерода в 2020 году было зафиксировано при влажности 16,6-22,3 % и температуре почвы 10,618,0 °С, и составляло 26,8629,51 г С/кг почвы. В 2021 году максимум С орг. отмечали при влажности 22,3 % и 19,5 °С — 27,81 г С/кг почвы.

В 2020 году наибольшее количество орга- нического углерода, ассоциированного с илистой фракцией, обнаружили в мае (p < 0,04) — 98,31 г С/кг фракции (рис. 4). Почвенные пробы, отобран- ные в конце августа, характеризовались наименьшим средним значением Сил., которое составляло 78,2 г С/кг фракции (p < 0,04).

В течение периода наблюдений происходило плавное снижение содержания Сил.. В 2021 году отмечали практически такую же тенденцию, однако разница между величинами Сил. в течение сезона не была достоверной (p < 0,35). При этом величины содержания Сил. в середине июля и в конце августа несколько превышали значения Сил. в 2020 году за аналогичный период. Вероятно, в 2021 году образование комплексов органического вещества с минералами илистой фракции почвы происходило в большей степени, чем в 2020 году.

Фактор обогащения (E soc ) илистой фракции органическим углеродом менялся от 3,66 в начале периода 2020 года до 3,11 по его окончании. В 2021 году величина E soc варьировала от 3,84 до 3,22.

Наибольшее содержание углерода, ассоциированного с илом, обнаружили при максимальной влажности и минимальной температуре почвы. Максимальное накопление углерода в илистой фракции фиксировали в 2020 году при влажности 16,6-22,3 % и 10,6-18 °С — от 92 до 98 г С/кг илистой фракции. В 2021 году наибольшее содержание С ил. было обнаружено в пробах почвы, имеющих влажность 16,2-22,3 % и отобранных при 17,3-23,7 °С, величины С ил. оказались сопоставимы со значениями С ил. в 2020 году. В 2020 году взаимосвязь депонирования С орг. и С ил. и температуры почвы была достоверной отрицательной обратно пропорциональной (соответственно r = -0,43 и r = -0,73, p < 0,05), в 2021 году эта связь сохранилась, однако носила недостоверный характер для С орг. ( r = -0,38) и достоверный — для С ил ( r = -0,76, p < 0,05). Корреляционный анализ взаимосвязи влажности почвы и содержания С орг. и С ил. выявил достоверные среднюю и сильную прямо пропорциональные положительные связи в 2020 году ( r = 0,66 и r = 0,89, p < 0,05) и сильную положительную достоверную связь для С ил. в 2021 году ( r = 0,90, p < 0,05), что согласуется с данными других авторов (52).

Таким образом, установлено влияние полифенолоксидаз и пероксидаз, а также влажности и температуры на содержание органического вещества в агродерново-подзолистой супесчаной почве и ее илистой фракции. Активность оксидаз в 2021 году была выше, чем в 2020 году: полифенолок-сидаз в среднем в 5 раз, пероксидаз — в среднем в 3 раза. Максимальное содержание общего органического углерода в течение всего периода наблюдений зафиксировано при максимальной активности полифенолок-сидаз (в 2020 году при ПФО = 1,27 мг пурпургаллина • г ^{- 1} •ч ^{- 1}, в 2021 при ПФО = 5,9 мг пурпургаллинат ^{- 1} •ч ^{- 1}; r = 0,48 и r = 0,84, p < 0,05). В 2021 году содержание общего органического углерода уменьшилось в среднем на 2 % по сравнению с 2020 годом (p < 0,63). Однако средние значения содержания С ил. за аналогичный период увеличились на 4,78 % (p < 0,43). Вследствие этого в 2021 году повысился коэффициент обогащения илистой фракции почвы. Связь активности оксидаз с содержанием органического углерода, ассоциированного с илистой фракцией, имела сложный характер, поскольку органическое вещество, закрепленное в илистой фракции, слабо подвержено воздействию микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности. Наибольшее влияние температура и влажность оказали на накопление углерода в илистой фракции почвы по сравнению с депонированием в ней общего органического углерода. При этом связь между влажностью почвы и накоплением С орг. и С ил. носила более сильный характер, чем связь между температурой почвы и накоплением С орг. и С ил .