Ферменты деградации рамногалактуронана I как факторы вирулентности фитопатогенной бактерии Pectobacterium atrosepticum

Представители рода Pectobacterium — одни из наиболее вредоносных фитопатогенов в мире (1). Эти микроорганизмы вызывают у растений заболевания, названные мягкими, или мокрыми, гнилями (2, 3). Ключевыми детерминантами патогенности пектобактерий считаются экстраклеточ-ные ферменты, расщепляющие полисахариды клеточной стенки, из которых наиболее разнообразны ферменты, разрушающие полигалактуроновую кислоту (гомогалактуронан). Этот полимер, содержащийся в основном в срединных пластинках, — самый представленный пектиновый полисаха-

* Работа частично поддержана грантом Российского научного фонда (¹ 15-14-10022).

рид растительных клеточных стенок (4). Его деструкция при развитии инфекции приводит к мацерации тканей (2, 3, 5). В многочисленных исследованиях продемонстрировано, что мутантные формы пектобактерий, у которых секреция ферментов, разрушающих полигалактуронан, отсутствует или снижена, не способны вызывать симптомы мягких гнилей (6-8).

Наряду с генами, кодирующими ферменты деструкции гомогалак-туронана, в геноме пектобактерий присутствуют гены ферментов деградации другого пектинового полисахарида — рамногалактуронана I (РГУ I). В отличие от гомогалактуронана (линейного гомополимера, состоящего из остатков галактуроновой кислоты), РГУ I — это разветвленный гетерополимер. Его остов представляет собой чередующиеся остатки рамнозы и галактуроновой кислоты, а боковые цепи, присоединенные к рамнозе, состоят из галактозы или арабинозы (4).

В наших предыдущих исследованиях было показано, что РГУ I играет важную роль в колонизации пектобактериями сосудов первичной ксилемы, где микроорганизмы формируют особые биопленкоподобные многоклеточные структуры, которые мы назвали бактериальными эмболами (9). В отличие от биопленок, в которых внеклеточный матрикс представлен в основном бактериальными экзополисахаридами (10-12), первичный матрикс бактериальных эмболов формируется из РГУ I (13). Этот полимер высвобождается из растительных клеточных стенок в результате восприимчивого ответа растений и формирует своеобразный микрокосм для сборки бактериальных эмболов. По мере созревания бактериального эмбола РГУ I в составе внеклеточного матрикса замещается экстраклеточ-ными полисахаридами пектобактерий (14). Это свидетельствует о динамичном преобразовании РГУ I при развитии инфекции. Однако для пек-тобактерий роль ферментов деградации РГУ I в патогенезе ранее не была продемонстрирована.

Мы впервые установили, что разрушение РГУ I в процессе инфекции вносит значительный вклад в развитие симптомов мягких гнилей, вызываемых Pectobacterium atrosepticum .

Цель настоящего исследования — проверка необходимости присутствия ферментов, разрушающих РГУ I, для развития мягких гнилей в растениях, инфицированных пектобактериями.

Методика . Штамм Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 (ранее Erwinia carotovora ssp. atroseptica SCRI1043) (15) (коллекция Белорусского государственного университета; любезно предоставлен Е.А. Николайчиком), Escherichia coli и штаммы, мутантные по локусам eca0852 ( ∆ eca0852) и eca3749 ( A eca3749), выращивали при 28 °C в среде Luria-Bertani (LB) (16), содержащей 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, рН 7,5. При необходимости добавляли антибиотики канамицин (30 мкг/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), тетрациклин (12,5 мкг/мл).

Поиск последовательностей целевых ферментов осуществляли с помощью алгоритма BLASTp в банках данных PDB (Protein Data Bank Europe, и UniProt . Филогенетическое древо строили методом ближайшего соседа; бутстрэп-поддержка указана у ветвей дерева. Молекулярно-филогенетический анализ выполняли в программе MEGA 6.0 . Биохимическое описание ферментов заимствовали из базы данных CAZy (CarbohydrateActive enZyme, .

Мутантный локус для нокаута генов eca0852 и eca3749 конструировали с помощью ПЦР по методу перекрывающегося сплайсинг-расши-рения. Большую часть кодирующей области гена удаляли, а на ее место в качестве маркера для селекции мутантных клеток встраивали кассету устойчивости к канамицину. Полученную конструкцию лигировали в суицидный мобилизуемый вектор pKNG101 (любезно предоставлен профессором L.N. Moleleki, университет Претории, ЮАР), и сконструированную таким образом плазмиду переносили в клетки донорного штамма E. coli СС118 при помощи электропорации. Рекомбинантный мутантный локус в составе полученной плазмиды вводили в клетки P. atrosepticum SCRI1043, используя трехродительское скрещивание. Клетки, получившие рекомбинантную плазмиду, отбирали на среде со стрептомицином и канамицином. Затем клетки, в которых прошел второй акт рекомбинации, сопряженный с заменой целевого гена и элиминацией донорной плазмиды, селектировали на среде с сахарозой. После этого отбирали клоны, устойчивые к канамицину и чувствительные к стрептомицину. Мутацию верифицировали с помощью ПЦР и определяли нуклеотидную последовательность мутантного локуса, как описано ранее (8).

Анализ мутантных форм пектобактерий на вирулентность проводили, оценивая массу пораженных (мацерированных) тканей листьев пекинской капусты (Brassica rapa spp. Pekinensis) сорта Cha Cha, инокулированных микроорганизмами. Клетки пектобактерий выращивали в среде LB до поздней логарифмической фазы роста, после чего собирали центрифугированием и ресуспендировали в 10 мМ растворе сульфата магния, менее стрессогенном для растений, чем хлорид натрия (17). Плотность инокулята доводили до 1½107-3½107 КОЕ/мл серийными разведениями. Поверхность листьев стерилизовали отбеливателем «Белизна» (содержание активного хлора 0,8 %) и 70 % раствором этанола. Затем листья промывали стерильной водой и делали небольшие надрезы, в которые вносили 10 мкл бактериальных суспензий (1½105-3½105 КОЕ/мл) или стерильного раствора сульфата магния. Инфицированные таким образом листья помещали в чашку Петри и инкубировали при 28 °C в течение 48 ч. Мацерированные ткани растения извлекали скальпелем и взвешивали. Результаты, полученные как минимум в 10 биологических повторностях, визуализировали в виде бокс-плотов, простроенных с помощью графического пакета ggplot2 . Для измерения пектатлиазной активности бактериальные клетки выращивали в синтетической среде D5 следующего состава, содержащей пектин в качестве единственного источника углерода: 13,6 г/л KH2PO4, 1,0 г/л NH4Cl, 0,3 г/л MgSO4 (добавляли в виде 100½ стокового раствора после стерилизации), 1,4 г/л NaOH, 2 г/л пектина, pH 7,5.

Пектатлиазную активность определяли по ранее описанной методике (18). Бесклеточный супернатант культур (50 мкл), выращенных в среде D5 в течение 24 ч при 28 °C в термостатируемом шейкере-инкубаторе (Orbi Safe, «Sanyo», Япония) при 160 об/мин смешивали с 450 мкл реакционной смеси (pH 8,5), содержащей 50 мМ Трис-HCl, 0,1 мМ CaCl2 и 0,05 % полигалактуроновой кислоты, инкубировали при 37 °С в течение 5 мин и оценивали возрастание поглощения при X = 235 нм на спектрофотометре Solar PB2201B (ЗАО «СОЛАР», Беларусь). За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную активность выражали в ед/мг белка.

Способность к роению оценивали при выращивании пектобакте-рий в полужидкой среде D5, содержащей 0,4 % микробиологического агара Pronadisa («Laboratorios CONDA, S.A.», Испания) и 2 г/л сахарозы или пектина. В полужидкий агар вносили 3 мкл культуры бактерий на ранней стационарной фазе роста, инкубировали при 28 °С и через 24 ч измеряли диаметр макроколоний.

Статистический анализ проводили с помощью стандартных математических методов (расчет средней M и среднеквадратического отклонения ±σ, сравнение средних по t -критерию Стьюдента) в программе Microsoft Excel 2000. Для визуализации значений массы мацерированных тканей использовали пакет ggplot2, уровень достоверности различий (p-значение) рассчитывали с помощью непараметрического теста Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты. Использованные штаммы бактерий, плазмиды и праймеры охарактеризованы в таблице 1.

1. Штаммы, плазмиды и праймеры, использованные для создания мутантных штаммов Pectobacterium atrosepticum (Pba), дефектных по генам, кодирующим рамногалактуронил гидролазу и галактаназу

Название          I                       Описание

Штаммы

Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 Дикий тип (15)

SCRI1043 ∆ 3749                   Мутант штамма SCRI1043 со вставкой кассеты устойчивости к Km в

хромосоме SCRI1043∆0852 Мутант штамма SCRI1043 со вставкой кассеты устойчивости к Km в хромосоме Escherichia coli CC118 Хозяин для суицидного вектора pKNG101 (ara, leu) araD lacX 74 galE galK PhoA20 thi-1 rpsE rpoB argE (am) recA1, SmR (19) НН26/pNJ5000 Мобилизующий штамм для конъюгативного переноса суицидного вектора pKNG101 в клетки Pba, TetR (20) Плазмиды pKD4 Матрица для ПЦР-амплификации кассеты устойчивости к канами-цину, KmR (21) pKNG101 Суицидный мобилизуемый вектор для инактивации целевых генов, pir-ori R6K mobRK2 sacB SmR (22) pKNG101∆3749 KmR, SmR, sacB, содержит регион хромосомной ДНК Pba c делетиро-ванным геном еса3749 pKNG101∆0852 KmR, SmR, sacB, содержит регион хромосомной ДНК Pba c делетиро-ванным геном еса0852 Праймеры upECA3749_F 5´-GCATGTTGACCGAGCTGTCC-3´ upECA3749_KmR 5´-GCCTACACAATCCGACTTCCCAATCCCACTCTTC-3´ dnECA3749_KmF 5´-CCCATGTCAGCCGTTAAGCGATATTCCCAATGTTGCCG-3´ dnECA3749_R 5´-CATGTCCCATCATTTCGCAAC-3´ Km3749_F 5´-GATTGGGAAGTCGGATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3´ Km3749_R 5´-GGAATATCGCTTAACGGCTGACATGGGAATTAGC-3´ chek 3749_F 5´-GTTGCGGTTGGCACGATGG-3´ chek 3749_R 5´-CGAACAGATGGCAATACGTCGG-3´ upECA0852_F 5´-CTAAAGTGTTCTTATTCGATGAGCCC-3´ upECA0852_KmR 5´-CATGTCAGCCGTTAAGTGCTTTACCCAACCAATATCCG-3´ dnECA0852_KmF 5´-CCTACACAATCGCAAATTCTCCAAATGTATAACACCG-3´ dnECA0852_R 5´-CGTCCACTTTCTTACGCCCTC-3´ Km0852_F 5´-GGGTAAAGCACTTAACGGCTGACATGGGAATTAGC-3´ Km0852_R 5´-CATTTGGAGAATTTGCGATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3´ chek 0852_F 5´-GTGTTGCGATTGGGCGGG-3´ chek 0852_R 5´-GTCTGTCGGTAACCAAAGAAAAGCG-3´ П р и м е ч а н и е. В индексах праймеров символы ECA3749 и ECA0852 обозначают локусы генов соответственно рамногалактуронил-гидролазы и галактоназы; F и R — соответственно прямой и обратный праймеры. Символ up соответствует амплификации участка выше предполагаемой делеции, dn — участка, следующего после удаляемого фрагмента. Символом Km обозначено добавление начального (F) или конечного (R) фрагмента кассеты канамициновой устойчивости плазмиды pKD4, расположенного с 5´-конца праймера (в начале индекса) или в 3´-конце праймера (в конце индекса). Праймеры chek инициируют амплификацию с проксимального и дистального участков интересующего локуса для определения его размера и секвенирования. Подробная схема эксперимента описана ранее K.A. Datsenko с соавт. (21).

Согласно аннотации, представленной в базах данных CAZy и UniProt, в геноме P. atrosepticum SCRI1043 присутствует 8 генов, кодирующих ферменты, которые разрушают РГУ I. Экспрессия этих генов повышается при колонизации пектобактериями растений-хозяев (23). Для нокаута генов, кодирующих ферменты деградации РГУ I, были выбраны геномные локусы eca3749 и eca0852 P. atrosepticum, один из которых кодирует фермент, расщепляющий остов РГУ I, а второй — боковые цепи. Последовательность первого локуса аннотирована как кодирующая рамногалактуро- нил-гидролазу — фермент, разрушающий остов РГУ I. Согласно аннотации, eca0852 кодирует галактаназу, расщепляющую боковые цепи РГУ I. С помощью филогенетического анализа подтверждено, что целевые ферменты ECA3749 и ECA0852 были близки к группам белков соответственно с рамногалактуронил-гидролазной и галактаназной активностью (рис. 1).

A

100 1001----------

Bacteria

---------4XUV Glycoside hydrolase family protein Thielavia terrestns*

C 3QWT Glycoside hydrolase family protein Salmonella entenca * . 3PMM Glycoside hydrolase family protein Klebsiella pneumoniae*

Gammaproteocacrena

fP011095250 probable unsaturated rhamnogalacluronyl hydrolase! Pectobactenum atrosepticum J

Firmicutes

■031521 unsaturated rhamnogalacluronyl hydrolase Bacillus subtilis-^

—034559 unsaturated rhamnogalacluronyl hydrolase Bacillus subMs * +

Bacteroidetes

3K11 Putative glycoside hydrolase Bacteroides thehatotaomicron*

Fungi

Aspergillus lw

CHa^omiaceae ‘

Б

IQQi -------P48842 endo-p-1.4-galactanase 1 Aspergillus aculeatus * +

• 74]  I—Q9Y7F8 endo-p-1.4-gaiactanase Aspergillus tubingensis +

' ।       Q5B153 endo-p-1 4-galactanase Aspergillus niduians * *4

• —У I            Q2UN61 probable arabinogalactan endo-p-1,4-galactanase Aspergillus oryzae

¹-----Q0CTQ7 probable arabinogalactan endo-p-1.4-galaclanase Aspergillus terreus

_____г A1D3T4 probable arabinogalactan endo-p-1,4-galactanase Neosartorya fischeri 100^LBOXPR3 probable arabinogalactan endo-p-1,4-galactanase Neosartorya fumigate

I P83691 endo-|$-1.4-galactanase Humicola insolens * +

1001-----P83692 endo-p-1.4-galactanase Thielavia heterothallica *

bactena--- Rammaproteohaclwa ^™'⁰⁹²⁴⁵⁶ P^robableendo-n,4-galacianase Pectob.ctenumатгомресит"^

m---------—-----------------------------P48841 endo-p-1,4-galactanase Ceilvibno japomcus +

Bacillus

10O1

—007013 gaiactanase Bacillus subtiiis +

-Q65CX5 endo-p-1 4-galactanase Bacillus hcheniformis* +

■P48843 Uncharactenzed protein Bacillus circuians

Рис. 1. Кладограммы аминокислотных последовательностей, наиболее схожих с рамногалакту-ронил-гидролазой Pectobacterium atrosepticum (ЕСА3749, WP011095250) (А) и β -1,4-эндогалак-таназой P. atrosepticum (ЕСА0852, WP011092456) (Б): «+» — белки с известными биохимическими характеристиками, « _* » — белки, для которых в литературе имеются данные рентгеноструктурного анализа.

Рис. 2. Бокс-плоты, отображающие распределение значений массы мацерированных тканей в листьях пекинской капусты ( Brassica rapa spp. Pekinensis ) сорта Cha Cha, инокулированных диким штаммом Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 (ДТ) и его формами, мутантными по геномным локусам eca3749 и eca0852 , которые кодируют соответственно рамногалактуронил-гидролазу и галактаназу. Темной горизонтальной линией внутри бокс-плота обозначено медианное значение массы мацерированной ткани, верхняя и нижняя граница отображают 1-й и 3-й квартили распределения проанализированных значений варианта, вертикальные линии — крайние значения, лежащие в пределах полутора межквартильных размахов; черные точки — значения, которые выходят за пределы полутора межквартильных размахов. Над скобками, объединяющими

бокс-плоты, приведены достоверности различий, рассчитанные с помощью непараметриче-

ского теста Вилкоксона.

Хромосомные мутанты P. atrosepticum , дефектные по генам eca0852 и eca3749 , были сконструированы посредством аллельного обмена с использованием суицидного вектора pKNG101 по ранее описанному протоколу (8). Чтобы оценить влияние целевых мутаций на способность P. atrosep-ticum вызывать мацерацию растительных тканей, листья пекинской капусты инокулировали дикой и мутантными формами пектобактерий. Масса мягкой гнили, производимой этими штаммами в течение 48 ч, различалась (рис. 2). Оба мутанта мацерировали растительную ткань значительно менее интенсивно, чем бактерии дикого типа. При этом мутация в гене, кодирующем галактаназу ЕСА0852, оказывала значительно больший эффект (см.

рис. 2). По всей вероятности, причина в том, что гидролиз боковых цепей РГУ I вносит больший вклад в процесс мацерации тканей, чем разрушение остова полимера. На листьях, инокулированных стерильным 10 мМ раствором хлорида магния, симптомов мацерации тканей не отмечали.

Возможное влияние мутаций в локусах eca3749 и eca0852 на активность ключевых факторов вирулентности — пектатлиаз (24), а также подвижность микроорганизмов, служащую критерием их вирулентности (2528), было проанализировано с применением соответствующих тестовых систем. В культурах in vitro при использовании пектина в качестве един- ственного источника углерода экстраклеточная пектатлиазная активность у обеих мутантных форм не отличалась от таковой у дикого типа (рис. 3).

При анализе роения микроорганизмов, которое обеспечивает системное

Рис. 3. Пектатлиазная активность в супернатантах культур Pectobacterium atro-septicum SCRI1043 дикого типа (ДТ) и мутантных форм с инактивированными геномными локусами eca0852 (инактивирован фермент ECA0852) и eca3749 (инактивирован фермент ECA3749) , которые кодируют соответственно галакта-назу и рамногалактуронил-гидролазу.

распространение пектобактерий по растительным тканям, способствуя расширению зоны мягкой гнили (25), мы также не обнаружили различий между дикой и мутантными формами P. atrosepticum . В полужидких синтетических средах, содержащих либо сахарозу, либо полигалакту-роновую кислоту, оба мутантных штамма и дикая форма распространялись с одинаковой скоростью (табл. 2). Все это означает, что снижение вирулентности штаммов, мутантных по геномным локусам eca3749 и eca0852 , не связано со снижением подвижности микроорганизмов и способности к разрушению гомогалактуронана.

Хотя РГУ I — менее представленный полимер во фракции пектинов по сравнению с полигалактуроновой кислотой (4), наши эксперименты указывают на важность его разрушения для развития мягких гнилей, вызываемых P. atrosepticum. Во-первых, это может быть связано с тем, что благодаря преобразованию РГУ I обеспечивается формирование своеобразного экстраклеточного матрикса для пектобактерий

2. Подвижность дикого штамма Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 и штаммов, мутантных по геномным локусам eca3749 и eca0852 (0,4 % агар)

Штамм	Диаметр колоний на средах, мм ( М ± σ )
	сахароза	полигалактуроновая кислота
SCRI1043	22±0,5	22±0,2
∆ eca3749	22±0,5	24±0,6
∆ eca0852	23±0,3	23±0,4

(13). Во-вторых, несмотря на то, что инактивация целевых локусов не приводила in vitro к снижению спо-

собности микроорганизмов разрушать гомогалактуро-нан (рис. 2), в системе in planta, где разные типы пектиновых веществ могут пред-

ставлять собой домены одной молекулы (29), неспособность разрушать РГУ I может сделать определенные участки гомогалактуронана недоступ- ными для пектобактериальных ферментов.

Таким образом, мы продемонстрировали, что инактивация генов ферментов катаболизма рамногалактуронана I (РГУ I) снижает способность пектобактерий вызывать симптомы мягких гнилей у растений. При этом разрушение боковых цепей этого полимера, по всей видимости, вносит больший вклад в процесс мацерации тканей хозяина, чем гидролиз остова, поскольку мутант по гену галактаназы характеризовался меньшей вирулентностью не только по сравнению с родительским штаммом дикого типа, но и с мутантом по гену рамногалактуронил-гидролазы. Полученные нами результаты позволяют отнести ферменты деградации РГУ I к факторам вирулентности фитопатогенных пектобактерий.