Ферменты метаболизма эстрогенов и рецепторы как факторы риска развития и прогноза при раке молочной железы

В структуре онкологической заболеваемости среди женского населения региона Сибири и Дальнего Востока рак молочной железы (РМЖ), как и по РФ, устойчиво занимает первое место. Отмечается неуклонный рост числа больных, увеличение показателей смертности и возникновение злокачественных новообразований этой локализации в более раннем возрасте по сравнению с прошлыми десятилетиями [7]. В качестве основных этиологических факторов для РМЖ рассматриваются гормональные, генетические и факторы внешней среды [4]. Недостаточная реализация репродуктивной функции, аборты, поздние первые роды, раннее наступление менархе, позднее наступление менопаузы, высокий уровень эстрогенов в сыворотке крови, пребывание в состоянии длительного стресса, применение гормональных препаратов, злоупотребление алкоголем, действие ионизирующего излучения и химических канцерогенов существенно повышают вероятность развития неопластического процесса в молочной железе [31, 37]. Как правило, опухоли молочной железы являются гормонозависимыми, но не все из них гормоночувствительны [10]. Косвенными признаками гормоно-чувствительности опухоли является пожилой (постменопаузальный) возраст больной, длительное «мягкое» течение заболевания, преимущественное метастазирование в мягкие ткани и кости [9].

Есть много свидетельств вовлечения эстрогенов в индукцию рака молочной железы, но точные механизмы гормонального канцерогенеза окончательно не изучены. Существует две основные теории, объясняющие взаимосвязь эстрогенов с процессом канцерогенеза в молочной железе: концепция образования стабильных и нестабильных аддуктов ДНК под влиянием метаболитов эстрогенов (генотоксический тип гормонального канцерогенеза) и концепция усиленной пролиферации (промоторный тип гормонального канцерогенеза). Однако эти теории не объяс- няют в полной мере развитие опухолевого процесса. Согласно генотоксическому типу гормонального канцерогенеза (рис. 1) эстрадиол может образовываться локально в ткани молочной железы из предшественников женских половых гормонов под действием фермента ароматазы. В дальнейшем в реакции, катализируемой 2- и 4-эстрогенгидроксилазами, эстрадиол превращается в катехолэстрогены, которые затем переходят в форму эстроген-хинонов и семихинонов. Сами гормоны (в частности, эстрогены) или их дериваты (катехолэстрогены или их свободнорадикальные метаболиты хиноны и семихиноны) способны оказывать непосредственное ДНК-повреждающее действие. При связывании хинонов с гуанином образуются конъюгаты, которые вычленяются из ДНК. Оставшийся после этих преобразований участок ДНК в процессе репликации может подвергаться точковым мутациям. Дополнительно хиноны способны вновь восстанавливаться с образованием генотоксичного 4-гидроксиэстрадиола. Последний в сочетании с 3,4-эстрадиол-хиноном участвует в редокс–цикле, в ходе которого образуются свободные радикалы и, как следствие, наблюдается повреждение ДНК. Согласно промо-торному типу гормонального канцерогенеза, увеличение концентрации стероидных и пептидных гормонов повышает митотическую активность тканей-мишеней, а также увеличивает вероятность повреждения генома за счет дополнительных факторов. В процессе пролиферации увеличивается количество мутаций и ограничивается время, необходимое для репарации повреждений. Эти два пути гормонального канцерогенеза могут обладать синергическим или аддитивным действием в отношении друг друга. Преобладающее влияние какого-то из этих путей определяется воздействием ряда эндогенных и экзогенных факторов. И в этом смысле значение метаболитов эстрогенов при развитии злокачественных образований за счет индукции генотоксических повреж-

Рис. 1. Метаболизм эстрогенов и возможные пути повреждения ДНК

дений при внегонадном синтезе эстрогенов достаточно велико [2, 30, 33]. Менее освещенным остается вопрос, касающийся влияния эстрогенов на особенности и характер течения рака молочной железы, чувствительность к лечению и возможный исход заболевания.

В данном обзоре рассмотрены и систематизированы литературные данные о значении различных ферментов метаболизма эстрогенов, участвующих в процессе канцерогенеза как возможных прогностических и предсказательных факторов развития и течения рака молочной железы.

Ароматаза

Ключевым и конечным этапом синтеза эстрогенов является конверсия андростендиона до эстрона и конверсия тестостерона до эстрадиола, катализируемая ферментом ароматазой (эстро-генсинтетазой). Интерес к данному ферменту обусловлен его способностью влиять на локальный уровень эстрогена в ткани молочной железы. В норме ароматазная активность выявлена в жировой ткани, в фибробластах кожи, в строме и паренхиме ткани молочной железы, в плаценте, мышечной и костной ткани, в гонадах [6]. Ген ароматазы человека локализуется на 15-й хромосоме и содержит 10 экзонов, только 9 из которых кодирующие. Ароматаза является цитохромзави-симым ферментом и обозначается как CYP19. В большинстве опухолей молочных желез уровни эстрогена модулируют рост опухоли и зависят от активности СYP19. Активность ароматазы обнаруживается в 60-70% опухолей молочных желез [14]. Для ароматазы, как и для многих других ферментов, характерен генетический полиморфизм. Выявлено 5 различных вариантов аллелей, отличающихся по количеству тетрануклеотидных повторов. Обнаружено, что аллель с наибольшим количеством тетрануклеотидных повторов (А1) выявляется в 2,5 раза чаще у больных РМЖ, опухоли которых содержали рецепторы эстрогенов или рецепторы прогестерона, по сравнению со здоровыми женщинами [1].

Выявлено, что высокая активность ароматазы характерна для больных РМЖ, преимущественно с III и IV стадиями заболевания, при размерах опухоли более 5 сантиметров [23]. Локальная продукция эстрогена в ткани молочной железы может обеспечивать уровни эстрадиола, достаточные для того, чтобы обеспечить развитие генотоксического типа гормонального канцерогенеза и запуск эндогенных путей мутагенеза [31]. Концентрация эстрогенов в венозной крови, оттекающей от молочной железы, выше, чем в общей циркулирующей или в артериальной крови. Это является доказательством присутствия ароматазы в молочной железе. В менопаузе уровень эстрадиола в крови значительно снижается, хотя в ткани молочной железы этого не происходит. Локальный уровень эстрогенов в ткани молочной железы у женщин с сохраненной менструальной функцией и женщин в менопаузе является одинаковым, несмотря на то, что в крови его концентрация различается в 10–50 раз [21, 32]. Такое явление можно объяснить либо локальным биосинтезом эстрогенов, либо их захватом из циркулирующей крови против тканевого градиента. Вклад того или иного механизма, обеспечивающего высокое содержание эстрогенов в опухолях, варьирует. Примерно для 12–15% опухолей нет убедительных свидетельств эндогенного биосинтеза гормонов. Но в большинстве наблюдений этот процесс присутствует, и он характерен для 37–42% новообразований. Есть сведения о том, что активность и экспрессия гена ароматазы выше в тех квадрантах молочной железы, в которых локализована опухоль. Мутации в любом из соответствующих участков гена ароматазы могут приводить к гиперэкспрессии этого фермента в ткани молочной железы. Активность ароматазы может стимулироваться интерлейкином-6 и фактором некроза опухолей альфа, а также соединениями, действующими через цАМФ, простагландином Е2 и сигнальной системой JAK-STAT [30, 33]. Таким образом, локальное образование эстрогенов в ткани молочной железы следует рассматривать как важный детерминирующий фактор эс-троген-индуцированного канцерогенеза, а повышенная активность ароматазы в опухоли может являться неблагоприятным прогностическим критерием при раке молочной железы.

Рецепторы стероидных гормонов

Считается, что наличие в опухоли рецепторов эстрогенов (РЭ) и рецепторов прогестерона (РП) свидетельствует об ее чувствительности к экзогенным гормонам и является прогностически благоприятным. Для большинства стероидных гормонов и соединений, близких им по структуре рецепторного аппарата, например тиреоидные гормоны, процесс передачи гормонального сигнала состоит из следующих этапов. Первый этап включает проникновение гормона в клетку. Затем идет его соединение в цитоплазме с соответствующим ядерным рецептором, который выходит в цитоплазму. Далее осуществляется транслокация комплекса «гормон-рецептор» в ядро, где происходит его связывание со специфическими участками ДНК, называемыми стероидчувствительными элементами. В конечном итоге эти события приводят к синтезу в клетке специфических гормонзависимых белков и соответствующим эффектам в ткани [11]. РП синтезируются в клетке под влиянием эстрогенов и, следовательно, являются показателем функциональной активности РЭ. Содержание рецепторов эстрогена и прогестерона всегда выше в высокодифференцированных опухолях, а также у больных, находящихся в постменопаузе, по сравнению с женщинами репродуктивного и пременопаузального возраста [12]. У 43– 49% больных РМЖ в пременопаузе и 60–63% пациенток в постменопаузе опухолевые клетки содержат РЭ и РП. Рецепторы эстрогенов и прогестерона отсутствуют у 20–28% больных в пременопаузе и 12–17% больных в постменопаузе. Известно, что при отсутствии гор-монорецепторов в опухоли прогноз менее благоприятен и риск возникновения рецидивов выше. Показано, что в рецептор-негативных опухолях пролиферация опухолевых клеток в 10 раз активнее. В рецептор-положительных опухолях эстрогены тоже стимулируют процессы пролиферации, однако они не достигают уровня, свойственного рецептор-негативным опухолям [18]. Определение рецепторов стероидных гормонов также важно для выбора тактики лечения и оценки эффективности проводимой гормонотерапии. Чувствительность опухоли к гормонам определяется сохранением в опухоли рецепторов, способных воспринять гормональный сигнал и транс-лоцировать его в ядро [12]. Есть сведения о существовании различных форм рецепторов эстрогенов и прогестерона: РЭ-альфа, РЭ-бета, РП-А и РП-В. Оба вида РЭ обладают практически одинаковым сродством к эстрадиолу. С присутствием РЭ-альфа в опухолях молочной железы связана чувствительность к тамоксифену. О роли РЭ-бета однозначных сведений нет. По данным некоторых исследователей, под влиянием курения про- исходит переход от экспрессии РЭ типа α к усилению экспрессии РЭ типа β. Причем РЭ типа α считаются условно-«хорошими», а РЭ типа β -условно-«плохими» в прогностическом плане [2, 35]. Соотношение между РП-А и РП-В в опухоли может быть различным. Выяснено, что РП-В быстрее реагирует на изменение уровня эстрадиола и отличается от РП-А по функциональной активности. РП-В – более сильный активатор транскрипции прогестерон-чувствительных генов [11]. При наличии в опухоли рецепторов двух видов (РЭ и РП) эффективность метода гормонотерапии составляет 50–70%. Если присутствуют только рецепторы одного вида (РЭ или РП), то эффективность снижается до 33–39%. Однако до сих пор остается нерешенным вопрос о том, почему около 40% рецептор-положительных опухолей резистентны к лечению гормонами и примерно в 11% случаев гормонотерапия успешна при рецептор-отрицательных опухолях [9]. В связи с этим дальнейшее изучение рецепторов стероидных гормонов совместно с различными аспектами метаболизма эстрогенов в опухолях молочной железы является очень актуальным для практической медицины.

Эстрогенгидроксилазы

Важным этапом метаболизма эстрогенов является серия последующих гидроксилирований, в процессе чего под действием ферментов 2- и 4-эстрогенгидроксилаз образуются катехолэстроге-ны, которые в результате дальнейших ферментных реакций превращаются в метоксиметаболиты, семихиноны, хиноны. Катехолэстрогены способны функционировать как сигнальные молекулы, действующие через эстрогеновые рецепторы, или же дать начало реактивным хинонам, что может привести к окислительным повреждениям ДНК [31]. Как уже упоминалось ранее, необходимыми компонентами развития гормонозависимых опухолей являются опосредованный гормональными рецепторами рост, метаболическая активация эстрогенов реактивными интермедиатами и индукция генетических мутаций метаболитами эстрогенов. Катехолэстрогены обладают мощной эстрогенной активностью, и они способны как лиганды связываться с рецепторами эстрогенов. К примеру, эстрогенная активность 2-гидроксиэстрадиола (2ОНЕ2) состав- ляет 40–55%, а 4-гидроксиэстрадиола (4ОНЕ2) – 75–90% от таковой для эстрадиола [38]. Эстро-генгидроксилазы являются цитохромзависимы-ми ферментами, на их активность влияет присутствие НАДФН. Эстрогенгидроксилазы кодируются несколькими классами генов цитохромов, такими как цитохромы Р450 1А1/1А2, Р450 3А4, Р450 1В1, Р450 1А2, Р450 2В1/2 и Р450 3А. Гидроксилирование во 2-м положении с образованием 2-гидроксикатехолэстрогенов осуществляется ферментом 2-гидроксилазой эстрогенов. 4-эстрогенгидроксилаза способствует гидроксилированию эстрогенов в 4-м положении [24]. Помимо НАДФН-зависимого гидроксилирования, 2- и 4-гидроксиэстрогены могут образовываться под влиянием специализированной пероксидазной системы, зависимой от присутствия в среде органических перекисей. Есть сведения, что 4-гидроксиэстрогены более канцерогенны, чем 2-гидроксиэстрогены. Это объясняется различиями между свойствами катехолэстрогенов. Для 2-гидроксиэстрогенов характерно слабое связывание с классическими рецепторами эстрадиола, очень умеренная эстрогенная активность и отсутствие способности индуцировать опухоли на известных эксперементальных моделях. Важно уточнение роли 2-гидроксипроизводных в связи с их вовлечением в последующие метаболические реакции, включая 2-метоксилирование. Есть данные, что 2-гидроксиэстрогены снижают активность катехол-О-метилтрансферазы и препятствуют инактивации 4-катехолэстрогенов [1]. Для 4-гидроксипроизводных характерна низкая скорость выведения из организма, что способствует более продолжительному их воздействию на организм. Кроме этого, их отличает большая тканевая концентрация и хорошее связывание с рецепторами эстрогена [5, 38]. При измерении концентрации метаболитов катехолэстрогенов в экстрактах клеток рака молочной железы у людей было обнаружено отношение 4ОНЕ2 к 2ОНЕ2 как 4/1 [15]. Аналогичные результаты были получены и при изучении образования ка-техолэстрогенов в микросомах при раке молочной железы у крыс [25]. Эти факты свидетельствуют о том, что и у людей, и у грызунов, склонных к эстроген-ассоциированному раку, преобладающее образование 4ОНЕ2 в органах может быть результатом увеличения концентраций канцерогенных метаболитов в соответствующих тканях. Дериваты 2-катехолэстрогенов (2,3-хиноны) образуют с ДНК стабильные аддукты, которые сохраняются в молекуле до тех пор, пока повреждения не будут репарированы. Производные 4-катехолэстрогенов (3,4-хиноны) образуют с ДНК депуринизирующие аддукты, оставляя после себя нерепарируемые беспуриновые участки, закрепляя, таким образом, генотоксическое повреждение [15].

Глютатион-з-трансфераза

Существует два основных пути инактивации катехолэстрогенов. Первый путь – конъюгирова-ние их хинонов с глутатионом. Он обеспечивается ферментом глутатион-S-трансферазой, который кодируется суперсемейством генов, расположенных на разных хромосомах. Этот фермент предотвращает генотоксические и канцерогенные эффекты хинонов и катехолэстрогенов, является интегральной частью биохимической защитной системы организма, обезвреживающей липофильные, мутагенные, токсические, канцерогенные соединения. Отмечено значительное увеличение среднего уровня глутатион-S-трансферазы (ГТ) в опухолевой ткани молочной железы по сравнению с нормальной тканью от того же пациента [22]. На основании характеристики первичной структуры, иммунохимических свойств и субстратной специфичности суперсемейство изоформ ГТ человека подразделяется на 6 классов: альфа (α), мю (µ), пи (π), тета (θ), каппа (κ) и микросомальная изоформа. Каждой изоформе данного фермента свойственны полиморфизмы. Гены глютатион-S-трансферазы различных классов картированны на хромосомах 1, 11, 22. Считается, что гены глютатион-S-трансферазы вовлечены в патогенез различных раков и выступают в качестве модификаторов и факторов риска при различных заболеваниях, связанных с неблагоприятным воздействием внешней среды. Одна из изоформ фермента ГT Р1-1 (класс π) является маркерным белком многих типов злокачественных опухолей. Различные полиморфизмы генов фермента ГТ приводят к появлению трех форм данного фермента, различающихся по уровню активности. Первая форма характеризуется нормальной активностью, две другие мутантные формы функционально менее активны. Есть данные, которые свидетельствуют о корреляции уровня экспрессии ГT Р1-1 со скоростью клеточной пролиферации [3]. Были получены результаты, подтверждающие наличие зависимости активности глутатион-S-трансферазы от митотического индекса опухолей молочной железы. Активность данного фермента снижалась у больных РМЖ с максимальным митотическим индексом [8]. Отмечено, что изоформы ГT различных классов способны нековалентно связывать гидрофобные лиганды, в том числе гем, билирубин, стероиды, желчные кислоты, ряд противоопухолевых препаратов и канцерогенов. Имеются сообщения об ингибирующем дозозависимом влиянии прогестерона (в диапазоне концентраций от 10-8 до 10-5М) на активность внутриклеточной ГT Р1 и способности подавлять пролиферацию клеток линии К562. Возможно, данный эффект связан с нарушением экспрессии гена ГT из-за изменения внутри клетки уровня реактивных форм кислорода, которые принимают участие в регуляции клеточного деления [3]. При изучении генетического полиморфизма глюта-тион-S-трансфераз на большой выборке людей было обнаружено, что в постменопаузе у женщин, которые являются носительницами гомозиготного нулевого генотипа ГT М1 (класс µ), в 2,5 раза повышен риск развития рака молочной железы. При наличии у данных больных избыточной массы тела (индекс массы тела более 24,7 кг/м2) риск заболеть РМЖ увеличивался семикратно. У носительниц нулевого генотипа ГT Т1 (класс θ) и низкоактивностных генотипов ГT Р1 наблюдалась тенденция к увеличению риска развития РМЖ, которая не зависела от менструального статуса, однако достоверных различий получено не было. Среди женщин с нулевым генотипом ГT Т1 значимое увеличение риска наблюдалось только в том случае, если имелось сообщение о потреблении алкоголя [17]. В одной из работ C.B. Ambrosone et al. выявлена значимая связь между нулевым генотипом ГT М1 и риском развития рака молочной железы [13], но эти данные не согласуются с исследованиями других авторов. Так, в исследованиях D.J. Hunter отсутствует связь между нулевыми генотипами ГT М1, ГT Т1 и повышенным риском в отношении РМЖ и отмечено снижение риска развития злокачественных новообразований молочной железы в пременопаузе у носительниц ГT Т1 нулевого генотипа [19]. Таким образом, генетический по- лиморфизм ферментов семейства глютатион-S-трансфераз вносит весомый вклад в развитие рака молочной железы наряду с воздействиями окружающей среды. Присутствие хотя бы одного предполагаемого высокорискового генотипа увеличивает вероятность развития злокачественных новообразований молочной железы. Разработка методов уменьшения генотоксических эффектов катехолэстрогенов посредством воздействия на этап конъюгирования хинонов с глутатионом могла бы снизить вероятность злокачественного перерождения клеток молочной железы. Безусловно, эта проблема требует дальнейшего изучения.

Катехол-О-метилтрансфераза

Другой путь инактивации катехолэстрогенов осуществляется ферментом катехол-О-метилтрансферазой (КОМТ) за счет метилирования катехолэстрогенов. Активность КОМТ достаточно высока в молочной железе, эндометрии, печени, почках, эритроцитах, а также в некоторых других органах. Интересно, что продукт этой реакции – 2-метоксиэстрадиол – обладает противоопухолевой активностью [23]. Есть сведения, что активность КОМТ может угнетаться 2-гидроксиэстрогенами, препятствуя инактивации 4-гидроксиэстрогенов, которые обладают выраженными канцерогенными и генотоксическими свойствами [2]. Снижение активности КОМТ может приводить к меньшей инактивации катехолэстрогенов. В настоящее время обнаружено три варианта распределения активности КОМТ в человеческой популяции: высокая (содержит два Н аллеля), средняя (содержит Н и L аллели), низкая (содержит два L аллеля). Выяснилось, что в крови больных раком молочной железы чаще представлен низкоактивностный вариант КОМТ. У гомозигот носителей аллеля с низкой активностью КОМТ риск развития РМЖ выше в 1,3–1,4 раза и возрастает еще значительнее при увеличении индекса массы тела и пролонгированного влияния эстрогенов. В работах C.S. Huang et al. показано, что наличие низкоак-тивностного генотипа КОМТ связано с 4-кратным увеличением риска заболеть РМЖ [20]. Генотип КОМТ в значительной степени коррелирует с клинической стадией заболевания и степенью метастазирования в региональные лим- фатические узлы молочной железы [26]. Таким образом, сочетание ослабленной инактивации катехолэстрогенов с повышенной массой тела формирует более выраженную предрасположенность к опухолевому процессу, чем каждый из этих факторов в отдельности [1]. Выявлено, что комбинация низко- или умеренноактивной КОМТ с ГТ М1 нулевым генотипом представляет в высшей степени увеличенный риск в отношении развития рака молочной железы. Высокая вероятность появления РМЖ была отмечена также для женщин, использовавших заместительную гормонотерапию и одновременно несущих низкоактивные варианты ферментов КОМТ и ГТ Т1 или ГТ Р1 [27].

Другие исследователи обнаружили, что у больных РМЖ, находящихся в пременопаузе, снижается частота L аллеля КОМТ, связанного с низкой активностью данного фермента. Наименьшая степень риска развития рака груди была определена у женщин с L/L генотипом КОМТ и низким индексом массы тела (≤ 25,4 кг/м2), находящихся в постменопаузе [29]. Однако при наличии пролонгированного воздействия эстрогенов умеренная и низкая активность КОМТ связана с повышенным риском развития РМЖ [27]. При исследовании генотипа КОМТ у больных в Северной Каролине были получены результаты, отрицающие связь этого параметра с вероятностью появления рака груди [28]. Группой P.A. Thompson et al. было высказано предположение о том, что значение КОМТ в канцерогенезе молочной железы опосредовано индексом массы тела и в зависимости от состояния менструального статуса может играть различные роли в этом процессе. По данным этих авторов, наиболее высокий риск развития РМЖ был ассоциирован с низкоактивностным аллелем КОМТ у полных женщин в пременопаузе и худых, находящихся в состоянии постменопаузы [36]. Использование гормонзаместительной терапии может в основном увеличивать риск рака молочной железы среди женщин со специфическими комбинациями опасных генотипов генов ГТ и КОМТ. Таким образом, данные литературы свидетельствуют о том, что генотип КОМТ в определенной мере позволяет судить о предрасположенности к возникновению рака молочной железы, которая тесно связана с репродуктивными событиями и действием гормонов. Изучив активность фермента КОМТ совместно с другими ферментами метаболизма эстрогенов, возможно, удастся найти показатели, имеющие прогностическое значение при развитии РМЖ.

Заключение

Определение содержания рецепторов эстрогенов и прогестерона, а также ферментов метаболизма эстрогенов (ароматазы, 2- и 4-эстроген-гидроксилаз, глутатион-S-трансферазы и катехол-О-метилтрансферазы) в опухолевой ткани молочной железы, вероятно, может служить прогностическим критерием в отношении ответа на выбранную терапию, продолжительности безре-цидивной выживаемости и исхода заболевания. Однако данные литературы по этому вопросу весьма противоречивы. Некоторые авторы утверждают о наличии связи между активностью ароматазы и размерами опухоли [6], другие такой связи не находят [16]. Нет однозначного мнения и о взаимосвязи активности ароматазы с рецепторным статусом опухоли при РМЖ [6, 16, 34]. Так, в работах J.R. Pasqualini обнаружена значительная обратная корреляция между экспрессией изоформы фермента ГТ класса π со статусом рецепторов [32]. Возможно, что наряду с неблагоприятным воздействием факторов окружающей среды общая сниженная активность ферментов инактивации катехолэстрогенов и повышенная активность ароматазы будут усиливать их генотоксическое воздействие.

Подводя итоги изучения литературных данных о различных этапах метаболизма эстрогенов, можно предположить, что изменение синтеза и инактивации гормонов играет важную роль в патогенезе рака молочной железы, но при этом наличие или отсутствие гормональных рецепторов не является надежным признаком прогноза развития опухолевого процесса и ответа на гормонотерапию. Необходимо дальнейшее углубленное изучение процессов метаболизма эстрогенов в опухолях молочной железы как на молекулярном, так и на биохимическом уровнях для уточнения роли ферментов метаболизма эстрогенов и рецепторов эстрогенов и прогестерона в качестве факторов прогноза при определении исхода заболевания и выбора адекватной тактики лечения у этих пациенток.