Фибробластическая реакция очага хронического воспаления при воздействии низкоинтенсивного у-излучения

Н.А. Клименко, Н.И. Онищенко

Харьковский государственный медицинский университет

На модели карагенанового хронического асептического воспаления у крыс показано, что низкоинтенсивное у-излуче-ние в малой дозе (0,1 Гр) вызывает усиление пролиферации и созревания фибробластов в очаге воспаления и значительные изменения интенсивности максимальной вспышки хемилюминесценции сыворотки крови. Полученные данные о стимуляции пролиферации фибробластов с возможным накоплением ошибок в структуре ДНК могут косвенно указывать на усиление онкогенного потенциала очага хронического воспаления при действии низкоинтенсивного i-излучения, особенно в малой дозе.

FIBROBLASTIC REACTION OF CHRONICAL INFLAMMATION UNDER THE ACTION OF LOW-INTENSITY y-RADIATION

N.A. Klimenko, N.I. Onischenko

Kharkov State Medical University

On a model of carrageenan-induced chronic aseptic inflammation in rats it is shown, that low dose-rate g-radiation at small dose (0,1 Gy) leads to increase of fibroblast proliferation in the inflammatory focus, and produces considerable modification of intensity of maximal outbreak of blood serum chemiluminescence. Obtained data on stimulation of proliferation in the inflammatory focus with possible accumulation of DNA errors can indirectly point to probability ofoncogenous potential increase in the chronic inflammatory focus at low dose-rate g-irradiation, especially at low dose.

В настоящее время приобретает большое значение вопрос о биологическом влиянии низкоинтенсивного у-излучения в небольших дозах. Такие параметры облучения соответствуют радиационным условиям в местах бывших ядер-ных катастроф, и именно такое излучение считается фактором возникновения злокачественных новообразований. Об этом свидетельствуют результаты многочисленных экспериментальных работ по радиационному канцерогенезу [2], а также эпидемиологических исследований по изучению последствий аварии на ЧАЭС [4] и атомных бомбардировок Хиросимы и Нагасаки [9].

В то же время воспаление также способствует возникновению злокачественных новообразований. Особенно это касается хронического воспаления, которое характеризуется персистирующей клеточной пролиферацией и считается предопухолевым состоянием, что также продемонстрировано в экспериментах на животных [3, б, 8]. Агентами, повреждающими ДНК, могут выступать свободные формы кислорода и окись азота, которые продуцируются клетками воспалительного экссудата и являются одними из основных медиаторов воспаления [5].

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния низкоинтенсивного у-излуче-ния в небольших дозах на количество незрелых и зр елых фибробластов в очаге и интенсивность хемилюминесценции сыворотки крови при хроническом воспалении в эксперименте.

Материалы и методы

Работа выполнена на 96 крысах-самцах линии Вистар массой 180—200 г. В качестве модели хронического воспаления было выбрано ка-рагенановое асептическое гранулематозное воспаление. Под кожу спины животным вводили 8 мл стерильного воздуха. Через 24 ч в полученный подкожный мешок вводили 4 мл 2% раствора Я-карагенана в изотоническом растворе NaCl. Раствор карагенана стерилизовали автокла- вированием при 121°С в течение 15 мин. Все процедуры выполняли под эфирной анестезией [7].

Для облучения использовали источник у-излучения (l3'Cs, 20 Ci, 14,3 мкГр/с на расстоянии 1 м, Германия). Такая интенсивность облучения соответствует радиационным условиям, в которых находились люди, проживавшие в местах ядерных катастроф. Животными были получены дозы 0,1; 0,5 и 1,0 Гр в течение 4,8; 24 и 48 ч соответственно. Доза в 0,1 Гр лежит в области так называемых малых доз (менее 0,2 Гр, или 1 трек на ядро), считавшихся до недавнего времени относительно безопасными. Доза в 1,0 Гр является классической радиобиологической дозой, эффекты которой хорошо изучены при остром облучении. Доза в 0,5 Гр находится в промежуточной области. Животных первой серии облучали на 3-й день воспаления. Вывод их из эксперимента осуществляли декапитацией под эфирным наркозом на 7-е сут воспаления. Животных второй серии облучали на 7-е сут, взятие материала для исследования проводили на 14-е сут воспаления. Контролем служили животные, у которых вызвали воспаление, но облучению не подвергали.

Для гистологического исследования брали кусочки мягких тканей из очага воспаления, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, подвергали стандартной проводке через спирты возрастающей концентрации и заливали парафином. Из приготовленных блоков делали серийные срезы толщиной 4-5x10"6м, которые окрашивали гематоксилином-эозином, пикрофуксином по ван-Гизону. В 10 полях зрения (увеличение в 400 раз) подсчитывали абсолютное число незрелых и зрелых фиброблас-тов и вычисляли количество клеток на одно поле зрения.

Для хемилюминесценции 1 мл полученной сыворотки крови вносили в измерительный тер-мостатованный при 37°С бюкс. Потом помещали перед фотокатодом фотоэлектронного умножителя. Измеряли фон установки при закрытой шторке, потом интенсивность спонтанного свечения при открытой шторке. После первой минуты измерения с помощью специального канала в бюкс добавляли 10% раствор пе-

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2005. №1 (13)

рекиси водорода. После добавления к объекту перекиси водорода наблюдалась характерная кинетика свечения, которую регистрировали на самопишущем приборе и на компьютере. Измеряли интенсивность максимальной вспышки • хемилюминесценции.

Для статистической обработки использовали непарный тест Стьюдента. Статистически значимыми считали различия результатов в сравниваемых группах при уровне значимости р<0,05.   "

Результаты и обсуждение

При изучении дозовой зависимости клеточного состава очага воспаления у животных, облучение которых проводили на 3-й сут, а выведение из эксперимента на 7-е сут воспаления, выявлено, что при дозе в 0,1 Гр количество незрелых фибробластов увеличено по сравнению с контролем (р<0,05) (рис. 1а).

При дозе 0,5 Гр значимой разницы по сравнению с контролем не отмечается. В то же время при дозе 1,0 Гр обнаруживается также достоверное увеличение содержания незрелых фибробластов в очаге воспаления, однако их меньше, чем при дозе 0,1 Гр. Таким образом, дозы в 0,1 и 1,0 Гр стимулируют к данному сроку воспаления пролиферацию фибробластов. Содержание зрелых фибробластов (рис. 1а) частично подтверждает картину, наблюдаемую для незрелых фибробластов. Увеличение количества зрелых фибробластов обнаруживается лишь при дозе 0,1 Гр, которая, по-видимому, стимулирует не только пролиферацию, но и созревание фибробластов.

Дозовая зависимость интенсивности хемилюминесценции у животных этой группы имеет почти линейный характер (рис. 2а). Следует отметить, что увеличение интенсивности свечения сыворотки при дозах 0,5 и 1,0 Гр является статистически значимым относительно контроля. Таким образом, выявлен радиационный дозозависимый эффект у животных через 4 дня после облучения. Можно предполагать, что за это время происходит накопление химических продуктов, образующихся в результате радиацион-

-------------------------------------------------- 55

Коп»*«естеофибро0п*7гоее гщюм none зрения. «4С0

Рис. 2. Максимальная вспышка хемилюминесценции сыворотки крови крыс, облученных на 3-и сут и выведенных из эксперимента на 7-е сут воспаления (а) и облученных на 7-е сут и выведенных из эксперименга на 14-е сут воспаления (б).

Примечание * - различия статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

Рис. 1. Количество незрелых (1) и зрелых (2) фибробластов в очаге воспаления у крыс, облученных на 3-и сут и выведенных из эксперимента на 7-е сут воспаления (а) и облученных на 7-е сут и выведенных из эксперимента на 14-е сут воспаления (б)

ной вспышки, причем только при дозах ОД и 1,0 Гр.

Таким образом, в проведенном исследовании выявлено два эффекта. Во-первых, показано, что низкоинтенсивное у-излучение в малой дозе вызывает усиление пролиферации фибробластов в очаге воспаления, в то время как ионизирующее излучение считается классическим фактором, угнетающим пролиферацию. Ингибирующее действие у-излучения на пролиферативную активность обычно связывают со способностью фотонов большой        энергии повреждать ДНК посредством как комптоновских электронов, так и активных форм кислорода, образующихся при радиолизе воды. В результате активация белков-регуляторов генома, таких как р53, р21, приводит либо к апоптозу клеток с поврежденной ного воздействия, таких как продукты перекисного окисления липидов, и структурных повреждений клеток, которые уже после прекращения облучения определяют радиационный эффект.

При изучении эффекта у-излучения у животных, облученных на 7-е сут и выведенных из эксперимента на 14-е сут воспаления, показано, что содержание фибробластов (рис. 16) увеличивается только при дозе 0,1 Гр за счет стимуляции пролиферации и, по-видимому, созревания фибробластов.

Дозовая зависимость показателей хемилюминесценции у животных этой группы представлена на рис. 26. Интересной особенностью является уменьшение интенсивности максималь-

ДНК, либо к выводу этих клеток из клеточного цикла в фазу покоя G Q . Как следствие, общее количество делящихся клеток уменьшается, и на макроскопическом уровне будет наблюдаться снижение общего темпа пролиферации. Данный механизм, по-видимому, срабатывает при большой мощности дозы и при больших дозах, когда в структуре повреждений ДНК преобладают двунитевые разрывы, которые не могут подвергаться восстановлению, и, соответственно, будут стимулировать регуляторную систему генома к ликвидации этих клеток путем апоптоза.

При воздействии же у-излучения с малой мощностью дозы, по-видимому, меньшим яв- ляется и количество повреждений ДНК за единицу времени за счет короткоживущих комптоновских электронов. Образующиеся при радиолизе воды активные формы кислорода накапливаются — их период жизни выше и сравним с продолжительностью облучения. Однако при малой дозе облучения (0,1 Гр) их содержание не достигает величины, способной вызвать значительное количество повреждений ДНК. Таким образом, можно предполагать, что при малой дозе и при малой мощности дозы интенсивность повреждения ДНК настолько мала, что в структуре ее повреждений преобладают однонитевые разрывы, которые могут ре-парировать, и, соответственно, механизмы, запускающие апоптоз или уход поврежденных клеток в фазу Go, не включаются совсем либо слабо выражены. Можно предполагать, что активация регуляторов генома имеет определенный порог; при дозе ОД Гр и при данной мощности дозы этот порог не достигается. Таким образом, интенсивность пролиферации не будет ослабляться, в то время как единичные ошибки в структуре ДНК будут накапливаться со временем, не подвергаясь радикальному удалению путем апоптоза. В то же время, по-видимому, очаг воспаления, как система, пытаясь противостоять гибели клеточного пула, включает механизмы, усиливающие выработку фибробластов из предшественников (стволовых клеток). Более того, образующиеся в результате радиолиза воды активные формы кислорода, аналогичные по структуре и активности медиаторам воспаления, вырабатываемым нейтрофилами и макрофагами, оказывают стимулирующее воздействие на пролиферацию в очаге воспаления. Таким образом, в целом будет наблюдаться усиление пролиферации с нарастанием во времени количества клеток с ошибками в структуре ДНК - потенциальными претендентами на злокачественную трансформацию. Вышеупомянутый механизм стимуляции пролиферации может иметь место и в случае облучения с большой мощностью дозы, однако интенсивность выключения клеток с поврежденной ДНК и интенсивность апоптоза будут, по-видимому, преобладать над стимулирующим воздействием со стороны других клеток в очаге воспаления.

Во-вторых, как известно, интенсивность хемилюминесценции характеризует течение реакций свободнорадикального перекисного окисления, главным образом липидов, служащих непременным спутником биологического обмена веществ. Свечение живых тканей в области длин волн 360-820 нм определяется свободнорадикальным окислением именно липидов в присутствии молекулярного кислорода. Следовательно, можно предполагать, что изменение интенсивности хемилюминесценции при указанных дозах , может говорить о возможном повреждении ДНК свободными радикалами перекисного окисления липидов. Согласно полученным в ходе эксперимента данным, вероятно, механизмы радиационного ответа при воспалении на 7-е сут отличны от таковых при воспалении на 3-й сут. При воспалении на 3-й сут наблюдается нарастающий дозозависимый линейный эффект, в то время как при воспалении на 7-е сут обнаруживается более высокая чувствительность к действию ионизирующего излучения в дозах 0,1 и 1,0 Гр и отсутствие ответа при дозе 0,5 Гр. Последнее явление можно объяснить несрабатыванием антиоксидантной защитной системы при малых дозах. Обнаруженный нами бимодальный характер кривой дозовой зависимости у второй группы животных был ранее впервые описан Е.Б. Бурлаковой и соавт. у облученных исходно здоровых животных [1], однако в нашем случае эффект при дозах 0,1 Гр и 1,0 Гр был не больше, а, наоборот, меньше, чем в контроле и при дозе 0,5 Гр. По-видимому, такое поведение кривой обусловлено предшествующим облучению воспалением, которое самостоятельно активирует перекисное окисление липидов и видоизменяет ответ организма на облучение.

Таким образом, полученные данные о стимуляции пролиферации фибробластов с возможным накоплением ошибок в структуре ДНК могут косвенно указывать на усиление онкогенного потенциала очага хронического воспаления при действии низкоинтенсивного у-излуче-ния, особенно в малых дозах.

Фибробластическая реакция очага хронического воспаления при воздействии низкоинтенсивного ^излучения