Фибронектин щитовидной железы собак при однократных и многократных мышечных нагрузках

Введение. Строма ЩЖ состоит из рыхлой волокнистой соединительной ткани, которую формируют четыре основных типа клеток соединительной ткани (фибробласты, макрофаги, тучные клетки и плазматические клетки) и три компонента внеклеточного матрикса (ВКМ): волокнистый – коллагены и эластин; сетчатые адгезивные белки – ламинин и фибронектин; основное вещество – протеогликаны. ВКМ является основой соединительной ткани и обеспечивает механическую поддержку клеток и транспорт химических веществ [1], [2].

Фибронектин (ФН) представляет собой гликопротеин, состоящий из двух разных субъединиц с молекулярной массой по ~250 КД, соединенных дисульфидными связями у С-концов [3] [17]. ФН продуцируется в основном фибробластами, а так же макрофагами, эндотелиоцитами, глиоцитами и эпителиальными клетками [4]. ФН представлен в виде двух форм: растворимой (циркулирующей в плазме крови и синтезируемой гепатоцитами) и нерастворимой [5]. Нерастворимая форма ФН в ЩЖ присутствует в интерцеллюлярном матриксе: базальной мембране, местах межклеточных контактов [6], интерфолликулярном стромальном каркасе и в стенке сосудов органа [7], [8].

Для идентификации фибронектина используют иммунохимический анализ поли- и моноклональными антителами (АТ), при этом стенка кровеносных сосудов это то место, где реакция наиболее выражена. Моноклональные AT специфичны к одной антигенной детерминанте и окрашивают только нерастворимую форму фибронектина [9].

ФН регулирует рост, организацию, пролиферацию и апоптоз клеток [10] [11] [12], участвует в восстановлении целостной структуры тканей [13], влияет на ремоделирование сосудов и плотность иннервации [13], оказывает стимулирующее действие на фибробласты, усиливая их миграцию и активируя синтез коллагена [15]. По данным литературы качество и эффективность этих функций связана с площадью, занимаемой фибронектином. Нарушение фибриллярных тяжей ФН ограничивает пролиферацию клеток и приводит их к гибели [16]. Традиционно увеличение объема фибронектина во ВКМ связывают с патологическими опухолевыми образованиями ЩЖ [1] [17] [18], однако, по нашему мнению, эта трактовка не столь однозначна.

Цель исследования – изучение площади нерастворимой фракции фибронектина щитовидной железы собак при различных видах двигательных нагрузок как отражение морфологических проявлений функциональной активности органа.

Материал и методы исследования. Объектом исследования являлись щитовидные железы собак. Измерения проводили на поперечном срезе центральной части правой доли ЩЖ (фиксатор 10% нейтральный формалин). Фибронектин позитивные структуры выявлялись после постановки иммуногистохимической окраски моноклональными антителами к фибронектину человека (Dako Inc.). При данном методе окрашиванию подвергались базальная мембрана, места межклеточных контактов, интерфолликулярный стромальный каркас и строма сосудов органа.

Контрольная группа представлена 16 животными. Экспериментальная группа получала кратковременные и длительные нагрузки при динамическом контроле частоты сердечных сокращений (ЧСС).

Однократные нагрузки представлены тремя видами воздействий: тренирующего характера (нагрузки первого этапа, 8 животных); стартового характера (нагрузки второго этапа, 12 животных), предельными нагрузками (14 животных).

Многократные воздействия были в виде циклов тренировки, каждый из которых состоял из тренирующих (первый этап) и стартовых нагрузок (второй этап) и представлены тремя группами. Первая группа (12 животных) после первого этапа тренирующих индивидуально дозированных двигательных нагрузок (ИДДН) получала воздействия стартового характера. Во второй группе (10 собак) тренирующими нагрузками и стартовыми ИДДН моделировали последовательно три цикла воздействий. В третьей группе (11 животных) формировали четыре цикла.

Захвату кадров на микроскопе «Lеika DMLS» камера «ССВ Camera DIGITAL Kocom» (увеличение 400) предшествовал качественный анализ препаратов, во время которого оценивалась локализация, расположение и ход волокон фибронектина, количество фибронектин положительных клеток. В программе Adobe Photoshop была произведена обработка фотографий с удалением артефактов и элементов, находящихся за пределами интерфолликулярных септ, т.о. анализу подвергался фибронектин, расположенный на базальной мембране, между фолликулами, в стенке сосудов. В программе Image Tools после предварительной геометрической калибровки и бинаризации изображения измерялась площадь, занимаемая ФН. На основе данных описательной статистики в программе «Statistica StatSoft, Inc., ver.10» и U-критерия Манна—Уитни проводили сравнение групп.

Результаты исследования и их обсуждение. Средняя ЧСС в контрольной группе составила 125±6,92 уд/мин.

Однократные воздействия. При нагрузках тренирующего характера достигалась интеграция элементов кардиореспираторного аппарата, что проявлялось стабилизацией показателей ЧСС на уровне 205±10,15 уд/мин и временем бега 27,76±4,67 мин. Нагрузки стартового характера, незначительные по продолжительности (время бега 8,25±0,73 мин), оказывали существенное влияние на организм (ЧСС 201±13,47 уд/мин).

Таблица 1

Характеристика групп при многократных воздействиях

Группа, цикл	Цикл, этап нагрузки	Количество нагрузок	Время бега (мин.)	ЧСС (уд/мин)
Первая группа 1 цикл (n=12)	1.1 этап	17,58±0,74	45,64±1,83	169±1,85
	1.2 этап	6,17 ±0,11	11,81±0,38	168±3,30
Вторая группа 3 цикла (n=10)	1.1 этап	19,1±0,96	33,49±1,26	174±2,11
	1.2 этап	8,4±0,22	10,5±0,28	172±2,47
	2.1 этап	10,7±1,3	51,11±2,31	165±1,99
	2.2 этап	8,8±0,36	10,03±0,26	172±2,34
	3.1 этап	8,5±0,78	64,02±3,46	168±2,35
Третья группа 4 цикла (n=11)	1.1 этап	15,9±0,99	29,53±0,91	179±1,86
	1.2 этап	7,08±0,31	9,8±0,19	180±2,45
	2.1 этап	12,25±0,9	43,78±1,24	178±2,05
	2.2 этап	7,5±0,34	9,82±0,23	186±2,55
	3.1 этап	10,92±0,47	56,05±1,82	180±2,17
	3.2 этап	7±0,75	9,94±0,22	184±2,78
	4.1 этап	10,5±1,25	71,3±2,56	173±2,56

У животных с предельными нагрузками (бег «до отказа») среднее время бега – 73,14±14,97 мин, средняя ЧСС во время бега – 191±6,41 уд/мин.

Многократные воздействия (Табл. 1). Для первой группы животных (первый цикл воздействий) общее количество нагрузок 23,25±0,66, после одного цикла тренирующих среднее время бега составило 45,64±1,83 мин, средняя ЧСС 169±1,85 уд/мин, после нагрузок второго этапа среднее время бега 11,81±0,38 мин, ЧСС 168±3,30 уд/мин.

Во второй группе животных третий цикл воздействий (общее количество нагрузок 55,50±2,45) приводит к росту времени бега до 64,02±3,4 мин и поддержанию средней ЧСС на уровне 168±2,35 уд/мин. Среднее время стартовых нагрузок 10,4±0,27 мин, ЧСС 172±2,38 уд/мин.

В третьей группе четвертый цикл воздействий (общее количество нагрузок 70,54±2,52) характеризуется некоторым возрастанием времени бега 71,3±2,56 мин при средней ЧСС 173,59±2,56 уд/мин. Среднее время бега при стартовых нагрузках составляло 9,85±0,25 мин, ЧСС 183,33±2,57 уд/мин.

Фибронектин позитивные структуры располагались в интерфолликулярном стромальном каркасе и были представлены в виде непрерывных и прерывистых тяжей с неровными извитыми или равномерными контурами. В зоне контакта их с базальной мембраной фолликулярных тироцитов имелись утолщения. При широком межфолликулярном пространстве тяжи располагались в основании тироцитов возле каждого из фолликулов, а пространство между ними занимали волокна соединительной ткани и/или интерстициальное пространство. При тесном контакте фолликулов волокна фибронектина формировали единый тяж с неровными извитыми контурами. Среди стромальных волокон встречались единичные фибронектин позитивные клетки, часто, неправильной треугольной формы, их количество в препаратах было различно. Фибронектин позитивная строма в составе базальных мембран эндотелия сосудов органа для артериол и венул, обычно, формировала замкнутый контур, а у сосудов ми-кроциркуляторного русла имела неравномерный прерывистый характер с местами истончения. Фибронектин позитивные структуры вен и венул занимали большую площадь, по сравнению с артериями и артериолами, но имели неравномерное представительство в стенке сосуда и нечеткие границы. Фибронектин стромы капсулы представлен непрерывными неравномерными тяжами, а в субкапсулярных венах имеет тонкий замкнутый контур.

Нельзя выделить принципиальные особенности фибронектин позитивной реакции стромы ЩЖ, характерной для животных какой-либо из описываемых групп. Общей тенденцией было наличие, как правило, замкнутого, непрерывного контура возле фолликулов небольшого диаметра в отличие от крупных и средних фолликулов, что, впрочем, могло быть связано с общей протяженностью длины окружности этих фолликулов. Для сосудистого русла было характерно увеличение площади ФН в стенке сосудов различного диаметра при их гиперемии.

Исследования выявили, что площадь ФН (мкм2) при однократных нагрузках стартового характера составила 308,14±18,45 и достоверно отличалась от контроля 99,62±7,09 (p<0,01). При нагрузках тренирующего характера площадь ФН – 90,93±5,33, при предельных нагрузках 125,45±10,04 (отличие от контроля, p<0,03).

При многократных воздействиях: в первой экспериментальной группе первого цикла воздействия площадь ФН составила 88,26±5,21; во второй группе – 99,55±7,67; в третьей группе – 102,51±4,61 мкм2.

Итак, однократные тренирующие и многократные нагрузки длительностью от одного до трех месяцев не оказывали существенного влияния на ФН ЩЖ. При однократных нагрузках стартового характера с минимальным временем бега и предельных нагрузках с максимальным временем бега, площадь ФН достоверно отличалась. Нагрузки данного типа приводили увеличению ЧСС, гиперемии сосудистого русла ЩЖ, появлению признаков гиперфункции органа.

Временной диапазон сборки матрицы фибронектина определен исследованиями To W.S. и др. [19] в 10 минут.

Мы полагаем, что при предельных нагрузках (время бега 73,14±14,97 мин) увеличение площади ФН может быть обусловлено активизаций тироци-тов и это согласуется с работами Matola T. Di и др. [11] об избирательном стимулировании синтеза и накопления нерастворимого фибронектина в ЩЖ сывороткой крови.

При нагрузках стартового характера (время бега 8,25±0,73 мин) увеличение ФН может происходить и за счет накопления интраваскулярной фракции, локализация его в составе сосудистой стенки обсуждается в работах Usenko V.S. и др. [9], Comi A.M. и др. [14], Murphy P.A., Hynes R.O. [7].

Таким образом, фибронектин, который традиционно рассматривается как маркер процессов новообразований щитовидной железы, может служить отражением и других изменений пролиферативной активности тироцитов.