Филогенетическая структура сообщества прокариот дерново-подзолистой почвы под озимой рожью не зависит от агротехнических приемов

Почва — это сложная экологическая система, где ключевую роль играют микробные сообщества, обеспечивающие нормальное функционирование биосферы (1, 2). Для сельского хозяйства особый интерес представляет таксономическая и функциональная структура микробного сообщества, которое формируется в разнообразных физико-химических условиях среды, под покровом разных видов растений. Большинство исследователей считают, что основным фактором формирования микробиоты ризосферы, и особенно ризопланы, служат растения, но, учитывая сложность взаимодействия в системе почва—микроорганизмы—растения, многие признают значительное влияние на структуру и разнообразие ризосферных микроорганизмов типа почвы, агротехнических мероприятий и климата (3-5).

^* Работа выполнена в рамках государственных заданий ¹ 0664-2018-0023 и ¹ 0664-2017-0050.

До сих пор ведется дискуссия о специфическом характере действия различных растений на микробиом почвы, что очень важно для понимания механизма взаимодействия микроорганизмов и растений, построения оптимальных севооборотов, организации мероприятий по защите сельскохозяйственных культур от фитопатогенных микроорганизмов и вредителей. В связи с этим особая роль отводится исследованиям микрофлоры почвы в длительных полевых опытах, в которых одна и та же культура возделывается в поле на протяжении многих лет. Такие опыты проводятся в России, Германии, Великобритании, США, Канаде, Франции (6). Тотальные исследования филогенетической структуры микробиома почвы в многофакторном долголетнем (более 100 лет) полевом опыте (МСХА им. К.А. Тимирязева, г. Москва) показали (7), что ключевым фактором филогенетического разнообразия микробиома служит вид возделываемого растения, вторым по значимости — известкование. Систематическое применение минеральных удобрений не имело заметного влияния на филогенетическую структуру микробиома почвы. При этом микробиомы почв, засеянных различными растениями, неодинаково реагируют на известкование (7).

Особый интерес представляет структура почвенного микробиома под озимой рожью. Это одна из немногих сельскохозяйственных культур, которую можно выращивать бессменно на протяжении десятилетий. Она имеет мощную корневую систему, сопоставимую с биомассой наземной части растений и достигающую 6 т/га (8). Общая площадь корней составляет около 6 тыс. м2, а их поверхность превышает поверхность наземной части в 130 раз (9). Корневые выделения достигают, по оценке некоторых авторов, 21 % от синтезируемой массы растений (10). Корневые выделения озимой ржи и ткани растений включают органические кислоты, сахара, глюкозиды циклических производных гидроксамовой кислоты, а также продукты их вторичной трансформации аглюканы и производные бензокси-золинона (11-13). Производные гидроксамовой кислоты и продукты их трансформации обладают гербицидными, фунгицидными и инсектицидными свойствами, обеспечивая защиту культуры от фитопатогенных грибов и ее высокую конкурентоспособность с сорняками (14-16). Это предполагает значительное влияние озимой ржи на почвенный микробиом.

E. Kurek с соавт. (17) показали, что численность прокариот в ризосфере озимой ржи выше, чем в почве. По их данным, в почве и в ризосфере растений преобладают грамположительные бактерии. Другие исследователи отмечают, что практически у всех полевых культур в ризосфере расие-ний, особенно в раннем возрасте, доминируют грамотрицательные бактерии (2, 9). По данным А.О. Зверева с соавт. (18), филогенетическая структура прокариот и их разнообразие в ризосфере озимой ржи в возрасте 42 сут и в парующей почве практически не различаются. И.Г. Широких с соавт. (19) обнаружили в ризосфере ржи значительное количество актиномицетов, видовая структура и численность которых изменялась в течение онтогенеза растений. Доминирующее положение занимали стрептомицеты. Данные о длительном влиянии культуры ржи на почвенную микрофлору отсутствуют.

В настоящей работе впервые представлены данные о филотипиче-ской структуре и разнообразия прокариотических микроорганизмов в почве при выращивании ржи в бессменной культуре в шестипольном севообороте на протяжении почти 100 лет (долголетний многофакторный полевой опыт, МСХА им. К.А. Тимирязева). Полученные результаты свидетельствуют, что растение служит основным фактором формирования почвенного прокариотического сообщества.

Нашей целью была оценка влияния разных агротехник (севообо- рот, известкование) в условиях длительного полевого опыта на филогенетическую структуру микроорганизмов в посевах ржи.

Методика . Образцы почвы отбирали в 2010 году на участке многолетнего опыта РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева, который был расположен на территории площадью около 1,5 га с уклоном 1 ° на северо-запад на моренной равнине в южной части Клинско-Дмитровской возвышенности. Высота над уровнем моря — 162 м, среднее количество осадков — около 600 мм в год, из них примерно половина приходилась на май—август, среднегодовая температура — 4,1 ° С. Почва дерново-подзолистая, песчаный крупно-пылеватый суглинок, старопахотная (более 200 лет под пашней) (20). Для филогенетического анализа комплекса прокариотических микроорганизмов в почве использовали делянки, засеянные озимой рожью ( Secale cereale L.), которая выращивалась в бессменной культуре и шестипольном севообороте с 1912 года. Севооборот включал чистый пар, озимую рожь, картофель, ячмень с подсевом клевера, клевер первого года пользования, лен. На опытные делянки ежегодно вносили минеральные удобрения, общий объем которых за годы исследований (1912-2009) составлял по азоту — 5820 кг, фосфору — 7990 кг, калию — 6716 кг/га. (20).

Почвенные пробы отбирали в фазу колошения озимой ржи на глубину пахотного горизонта А1 (0-20 см) в 5 повторностях, из которых составляли средний образец, который тщательно перемешивали

При выделении ДНК из образца почвы навеску (0,2 г) помещали в эппендорф объемом 2 мл, добавляли равный объем стеклянных шариков диаметром 0,1 мм («Innomed», Венгрия), 350 мкл раствора А (20 мM натрий-фосфатный буфер, 240 мM изотиоцианат гуанидина, рН 7,0), 350 мкл раствора Б (500 мM Трис-НCl, 1 % SDS, pH 7,0) и 400 мкл смеси фенола с хлороформом. Пробирку помещали в гомогенизатор FastPrep-24 («MP Biomedicals», США) и разрушали пробу в течение 10-15 мин. Затем центрифугировали при 10000-15000 g в течение 5 мин, отбирали водную фазу. После гомогенизации к образцу приливали 400 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали на вортексе в течение 1 мин, центрифугировали при тех же условиях, что и на предыдущей стадии, отбирали водную фазу. К неочищенному экстракту ДНК добавляли равный объем изопропилового спирта, вортексировали, центрифугировали, дважды промывали 70 % этанолом, сушили на воздухе. Осадок растворяли в 100 мкл воды при 65 ° С в течение 15 мин.

ДНК очищали от примесей электрофорезом в 1 % агарозном геле. Вырезанный блок агарозы, содержащий ДНК, помещали в эппендорф (1,5 мл), добавляли 2 объема раствора В (3 М изотиоцианат гуанидина, 20 мM Трис-HCl , 20 мг/мл Тритона X-100, рН 7,0) и инкубировали при температуре 65 ° С до полного растворения блока. К раствору добавляли 20 мкл раствора Г (раствор В с добавлением окиси кремния, 40 мг/мл), перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая. Затем центрифугировали при 10000-15000 g в течение 1 мин, полностью убирали супернатант, осадок суспендировали в 200 мкл раствора Д (25 % этанола, 25 % изопропанола, 100 мM NaCl, 10 мM Трис-HCl, рН 7,0), центрифугировали при 10000-15000 g в течение 1 мин, удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в этаноле, снова центрифугировали в течение 1 мин и удаляли супернатант. Осадок подсушивали на воздухе в течение 15 мин, добавляли 50 мкл элюирующего буфера (10 мM Трис-HCl, 1 мM EDTA, рН 8,0) и встряхивали на вортексе в течение 30 мин. После этого образцы центрифугировали и отбирали супернатант, избегая попадания окиси кремния в очищенный препарат ДНК.

Выделенная тотальная почвенная ДНК служила матрицей для секвенирования нуклеотидных последовательностей. Использовали универсальные праймеры к вариабельному участку V4 гена 16S рРНК (F515 — 5´-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3´, R806 — 5´-GGATACVSGGGTAT-CTAAT-3´) с добавлением олигонуклеотидных идентификаторов для каждой пробы и служебных последовательностей, необходимых для высокопроизводительного секвенирования по протоколу «Roche» (Швейцария). Подготовку проб и секвенирование проводили на приборе GS Junior («Roche», Швейцария) согласно рекомендации производителя. Таксономическую идентификацию последовательностей ДНК и сравнительный анализ микробных сообществ выполняли с использованием VAMPS (Visualization and Analysis of Microbial Population Structure) . Дополнительно для расширенной филогенетической характеристики последовательностей также пользовались базой данных RDP (Ribosomal Database Project, .

Результаты . Агрохимическая характеристика почвы на дату отбора почвенных образцов представлена в таблице.

Агрохимическая характеристика дерново-подзолистой почвы на участках многолетнего опыта под посевами озимой ржи (опытное поле РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева, г. Москва, 2010 год)

Вариант опыта	N общ. , %	P 2 O 5 , мг/100г	K 2 O, мг/100г	С общ. , %	рН сол.	Сумма обменных оснований, мг-экв/100г
Рожь севооборот	0,090	31,45	4,25	0,79	4,2	8,00
Рожь севооборот + известь	0,098	31,85	4,63	0,93	5,7	7,75
Рожь бессменно	0,112	53,80	24,70	1,28	4,6	8,63
Рожь бессменно + известь	0,095	53,70	21,51	0,98	6,1	8,25

Рис. 1. Таксономическое разнообразие прокариотических микроорганизмов дерново-подзолистой почвы (на уровне фил) на участках многолетнего опыта под посевами озимой ржи в зависимости от технологии выращивания: I — в севообороте с известкованием почвы, II — в севообороте без известкования почвы, III — бессменная культура с известкованием почвы, IV — бессменная культура без известкования почвы (опытное поле РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева, г. Москва, 2010 год).

При высокопроизводительном пиросеквенировании амплифицированной ДНК из почвенных образцов в составе микробного сообщества дерново-подзолистой почвы под посевами озимой ржи выявили 16 фил бактерий и 2 филы архей. Доминирующее положение занимали две бактериальные филы — Proteobacteria (от 34 до 56 %) и Actinobacteria (от 15 до 26 %). Филы Acidobacteria и Firmicutes составляли от 3,5 до 7,5 %, а археи — от 3,0 до 8,5 % от общего числа прокариотических микроорганизмов (рис. 1).

В составе почвенного прокариотического сообщества было выявлено около 300 родов микроорганизмов. Из них всего у 41 (что не превышало 13 % от общего числа таксонов) ча- стота была более 1 % (рис. 2). Во всех вариантах опыта встречались 12 родов, независимо от технологии выращивания озимой ржи (севоборот, бессменная культура, известкование). По-видимому, они составляли коровый комплекс прокариот, характерный для исследованного типа почвы под посевами озимой ржи. В этом комплексе доминировали бактерии, относящиеся к филам Protobacteria и Actinobacteria, а также неидентифицируе-мая бактерия (см. рис. 2). Доминирующее развитие этих таксонов в ризосфере озимой ржи наблюдали другие авторы (2, 18), с чем согласуются результаты наших исследований.

Микроорганизм I II III IV Рис. 2. Теплокарта доминирующих прокариотических микроорганизмов дерново-подзолистой почвы (на уровне рода) Acidobacteria Gp6 0,99 1,85 0,37 1,42 Acidobacteria Gp16 0,58 1,50 0,87 2,24 Acidobacteria Gp1 0,58 0,45 3,29 0,67 на участках многолетнего опыта под по- Acidobacteria Gp4 0,58 1,00 0,31 0,89 севами озимой ржи в зависимости от Acidobacteria Gp3 0,25 0,65 1,49 0,37 технологии выращивания: I — в севооб- Actinobacteria genus NA18 4,47 7,44 5,21 6,18 ороте с известкованием почвы, II — Actinobacteria genus NA17 1,66 2,70 2,73 2,76 бессменная культура с известкованием почвы, III — в севообороте без известкования почвы, IV — бессменная культура без известкования почвы; градации цвета от белого до темно-серого — Solirubrobacter sp. 1,41 1,45 1,43 1,86 Actinobacteria genus NA16 1,08 2,15 2,42 1,86 Arthrobacter sp. 0,91 1,50 0,93 1,12 Actinobacteria genus NA11 0,58 0,70 0,74 0,97 Streptomyces sp. 0,50 1,05 0,37 1,04 Conexibacter sp. 0,50 0,35 1,05 0,60 относительная численность микроор- Nocardioides sp. 0,25 0,95 0,50 1,19 ганизмов (в процентах) соответственно Actinobacteria genus NA5 0,17 1,40 0,37 0,60 ≤ 1; 1,01-5; 5,01-10 и > 10 (опытное по- Bacteroidetes genus NA2 0,50 1,55 0,37 1,04 ле РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева, Crenarchaeota genus NA 2,24 0,85 2,42 1,42 г. Москва, 2010 год). Firmicutes genus NA1 1,08 1,15 1,12 1,19 Firmicutes genus NA5 0,83 1,10 1,24 1,56 Согласно кривым доми- Paenibacillus sp. 0,75 0,70 1,05 0,07 Bacillus sp. 0,58 0,85 0,93 0,67 нирования (разнообразия) про- Gemmatimonas sp. 0,66 1,10 1,74 0,89 Bacteria genus NA 9,02 15,43 13,08 13,56 кариотного комплекса в почве, Archaea genus NA 4,22 2,50 5,95 4,47 наибольшее видовое богатство прокариотических микроорга- Rhizobium sp. 25,83 6,04 13,14 6,33 Proteobacteria genus NA7 14,90 3,55 3,60 3,80 Proteobacteria genus NA24 2,15 4,20 2,36 3,13 низмов обнаружили под бес- Proteobacteria genus NA30 1,57 1,55 3,35 2,76 сменной культурой ржи (рис. 3). В посевах ржи, выращиваемой Proteobacteria genus NA6 1,41 0,05 0,12 0,15 Proteobacteria genus NA28 0,75 1,35 0,43 1,04 Pseudomonas sp. 0,66 0,45 0,74 1,34 в условиях шестипольного севооборота, оно было существенно ниже. Низкое видовое богатс- Bradyrhizobium sp. 0,58 0,85 0,93 0,60 Proteobacteria genus NA15 0,50 1,00 1,43 1,27 Sphingomonas sp. 0,41 0,95 0,50 1,27 Proteobacteria genus NA36 0,41 1,45 0,68 1,27 тво в последнем случае, по-ви-димому, объясняется тем, что Proteobacteria genus NA34 0,33 1,00 0,93 0,97 Hyphomicrobium sp. 0,17 1,05 0,12 1,42 Verrucomicrobia genus NA2 1,08 2,20 1,12 1,19 предшественниками ржи были лен и парующее поле, где поступление в почву свежего органического вещества как источника питания и энергетического материала микроорганизмов крайне ограничено. Эти наблюдения позволяют сделать вывод об определенном влиянии предшественника на видовое богатство и разнообразие прокариотического комплекса микроорганизмов почвы в посевах озимой ржи.

Во всех вариантах опыта доминирующее положение среди про-теобактерий занимал род Rhizobium . Филогенетически Rhizobium очень близок к родам Agrobacterium и Allorhizobim , входящим в семейство Rhizobiaceae , которые в настоящее время объединены в филогенетическую группу Rhizo-bium—Agrobacterium . Более того, J.M. Young с соавт. (21) на основании филогенетического сходства предложили объединить эти бактерии в один род — Rhizobium . Полученные нами результаты о доминирующем положении

Ранг

Рис. 3. Кривые доминирования (разнообразия) прокариотного комплекса в дерново-подзолистой почве на участках многолетнего опыта под посевами озимой ржи в зависимости от технологии выращивания: 1 — в севообороте с известкованием почвы, 2 — в севообороте без известкования почвы, 3 — бессменная культура с известкованием почвы, 4 — бессменная культура без известкования почвы

(опытное поле РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева, г. Москва, 2010 год).

бактерий рода Rhizobium в почве под покровом озимой ржи следует рассматривать, по меньшей мере, как доминирующее положение бактерий группы Rhizobium—Agrobacterium , учитывая степень их родства и разрешающую способность используемого нами метода.

Значительное количество микроорганизмов из этой группы в почве и ризосфере растений отмечали многие авторы. По мнению М. Садовски с соавт. (22), клубеньковые бактерии ( Rhizobium sp. и Bradirhizobium sp.) достаточно широко распространены и составляют до 8,0 % от общего количества бактерий в почве. О наличии представителей Rhizobiaceae , в том числе клубеньковых бактерий, в ризосфере и корнях злаковых культур сообщалось в ряде работ (18, 23, 24). Некоторые исследователи называют клубеньковые бактерии эндофитами злаковых культур (25-27). А.О. Зверев с соавт. (18) на основе филогенетического анализа обнаружили в ризосфере 42-суточной культуры озимой ржи клубеньковые бактерии рода Mezo-rhizobium , относящиеся к этому семейству. Ни в одном случае не был вы-влен патогенез озимой ржи, вызванный Agrobacterium tumifaciens (28).

Наличие семейства Rhizobiaceae в почве под посевами озимой ржи в длительных опытах, по нашему мнению, объясняется тем, что в условиях шестипольного севооборота два поля были заняты клевером. Клубеньковые бактерии, присутствующие в посевах клевера, пережили период, когда почва была занята предшественниками озимой ржи (лен, чистый пар), и нашли благоприятные условия для своего развития под покровом этой культуры. Последнее с биологической точки зрения представляет интерес для оценки адаптации и выживаемости клубеньковых бактерий в агроценозах.

Что касается бессменной культуры ржи, то следует отметить, что перед закладкой опыта 100 лет назад это поле было несколько лет занято клевером (20). Кроме того, бактерии рода Rhizobium могут существовать в почве, не фиксируя атмосферный азот. Возможно, клубеньковые бактерии адаптировались и прижились в ризосфере растений как ассоциативные эндосимбионты. Наличие такой ассоциации с зерновыми колосовыми культурами клубеньковых бактерий Bradirhizobium sp., Agrobacterium sp., Rhizobium sp. отмечено в других работах (25, 27). Нельзя исключить и то, что в бессменной культуре ржи за 100 лет сформировалась своя микрофлора, важным компонентом которой стали бактерии семейства Rhizobiaceae . Отсюда вытекает интерес для глубокого анализа эволюции взаимоотношений Rhizo-biaceae с зерновыми культурами, в частности с озимой рожью, и прикладное значение этих исследований. Так, на основе непатогенной Agrobacterium radiobacter уже созданы биопрепараты, которые успешно используются на посевах злаковых культур (29).

Известкование практически не оказывало влияния на видовое богатство в посевах бессменной ржи, но резко снижало его в севообороте (см. рис. 3). Мы не обнаружили прямой зависимости биоразнообразия прокариот от величины рН. Крупные таксоны на уровне фил присутствовали во всех вариантах опыта. Изменение филогенетической структуры прокариот наблюдались на уровне рода, вида и штамма микроорганизмов. Так, при известковании снижалась относительная численность одних видов ацидобактерий, но увеличивалось количество других, что свидетельствует о перегруппировке таксономического состава прокариот. Это несколько противоречит традиционной точке зрения о безусловном положительном влиянии известкования кислых почв на микрофлору (30, 31). Однако следует отметить, что в последние годы накоплен материал, который дает противоречивую оценку действия известкования на сообщество почвенных микроорганизмов. Если по данным одних авторов (32, 33) известкование повышало биомассу микроорганизмов и интенсивность дыхания почвы, то другие исследователи (34) показали, что изменения рН красноземов как в кислую, так и в щелочную сторону приводило к снижению биомассы микроорганизмов. В работе N. Kennedy с соавт. (35) наряду с увеличением микробиологической активности при известковании наблюдалось изменение филогенетической структуры и снижение разнообразия бактериального сообщества почвы. Неодинаковое действие известкования на филогенетическое разнообразие прокариот под покровом разных растений отмечали И.О. Корвиго с соавт. (7). В частности, в звене севооборота картофеля и льна (предшественников озимой ржи) известкование приводило к снижению разнообразия прокариот, что соответствует результатам наших исследований.

Таким образом, анализ филогенетической структуры и разнообразия прокариотических микроорганизмов дерново-подзолистой почвы в условиях многолетней культуры ржи показал, что растение служит основным фактором формирования прокариотического сообщества. Независимо от агротехнических приемов, под покровом озимой ржи в фазу колошения складывается одинаковый по структуре коровый комплекс прокариот, включающий небольшое число видов протеобактерий и актинобактерий. Доминирующее положение среди них занимают бактерии семейства Rhizo-biaceae , в частности род Rhizobium , входящий в филогенетическую группу Rhizobium—Agrobacterium , что в определенной степени связано с историей опытного поля. По-видимому, бактерии этого семейства, прежде всего клубеньковые, находят в ризосфере ржи благоприятные условия для развития. Влияние известкования на структуру сообщества прокариот кислых почв может быть разным. Существенное значение, по-видимому, имеет конкретный вид растений, а также история поля (севооборот, бессменная культура, система удобрений и т.д.). Дальнейшие исследования жизнеспособности Rhizobiaceae в посевах озимой ржи и их эволюции в сторону ассоциативных эндосимбиотических взаимоотношений с растениями ржи в процессе длительного совместного существования представляют несомненный научный интерес.

Авторы выражают глубокую благодарность заведующему кафедрой земледелия и опытного дела РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева профессору М.А. Мазирову и профессору Н.Ф. Хохлову за помощь и предоставленную возможность отбора почвенных образов на поле длительного многофакторного опыта, заложенного А.Г. Дояренко в 1912 году.