Филогенетический анализ штаммов рода Rhizobium, выделенных из клубеньков Vavilovia formosa (Stev.) Fed

Триба Fabeae (син. Vicieae ) — одна из наиболее представительных в семействе Бобовые ( Fabaceae Endl.). Она состоит более чем из 300 видов, причем ее таксономическая структура до сих пор подвергается существенным изменениям. Многие виды этой трибы имеют важное сельскохозяйственное значение. В ее состав входят одни из самых древних культивируемых видов растений — горох посевной ( Pisum sativum L.) и вика посев-

Работа поддержана грантом Российского научного фонда 14-26-00094. Исследования выполняли с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» (ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург—Пушкин).

ная ( Vicia sativa L.) (1). Из пяти родов трибы Fabeae ( Lathyrus L., Vicia L., Lens Mill., Pisum L. и Vavilovia Fed.) самым малоизученным остается последний, содержащий единственный вид Vavilovia formosa (Stev.) Fed. Ареал вавиловии расположен на высокогорье Центрального и Восточного Кавказа, известны всего несколько популяций на территориях Армении (2), Дагестана и Северной Осетии (3), Азербайджана (4), Ирана, Ирака, Сирии и Турции (5), а ее произрастание ограничено условиями среды обитания (6). Поэтому само растение и его микросимбионты до недавнего времени оставались неизученными.

Недавно полученные данные по таксономическому положению ва-виловии прекрасной, основанные на филогенетически значимых генах matK , trnL-F и trnS-G , а также фрагменте ITS (internally transcribed spacer), свидетельствуют, что она наиболее близка к родам Pisum и Lathyrus , однако формирует отдельный кластер внутри трибы Fabeae (7). Единственное филогенетическое исследование изолятов ризобий из клубеньков вавило-вии североосетинской популяции показало достаточно широкое видовое и генетическое разнообразие как быстрорастущих, так и медленнорастущих микросимбионтов (8).

В той же работе было установлено, что все быстрорастущие изоля-ты, принадлежащие к виду R. leguminosarum , несут ген nodX , характерный для симбионтов Pisum sativum сорта Afghanistan (9). Все известные растения трибы Fabeae формируют группу перекрестной инокуляции и образуют клубеньки с бактериями этого же вида, причем для формирования симбиоза наличие гена nodX в большинстве случаев не обязательно. Однако в геноме P. sativum cv. Afghanistan (так называемого афганского гороха) присутствует аллель sym2^A , кодирующий рецептор, который специфично связывается только с Nod-фактором, декорированным дополнительной ацетильной группой, присоединенной под контролем гена nodX (10).

В настоящее время направление по изучению роли гена nodX в обеспечении индивидуального взаимодействия между бобовым растением и ризобиальными бактериями развивается очень активно (11). Представленные выше данные позволяют считать вавиловию прекрасную и ее микросимбионтов перспективными модельными объектами для исследования механизмов эволюции специфичности в бобово-ризобиальном симбиозае.

Благодаря удачным экспедициям в различные регионы Кавказа, наша исследовательская группа располагает образцами растений вавило-вии прекрасной и штаммов ризобий, выделенных из их клубеньков.

Целью настоящей работы было определение видовой принадлежности быстрорастущих изолятов ризобий из клубеньков вавиловии прекрасной на основании последовательностей фрагмента ITS, а также выявление особенностей хозяйской специфичности, которые могут быть оценены при помощи филогенетического анализа генов nodA и nodX . Мы также провели сравнение генетических расстояний, оцененных по последовательностям ITS и nodA в генотипе штаммов ризобий, выделенных из клебеньков разных растений-хозяев в различных географических регионах, для выявления экологически значимых показателей полиморфизма изучаемых изолятов.

Методика. Растения вавиловии прекрасной с клубеньками были собраны в 2012-2013 годах в Северо-Осетинском заповеднике (Северная Осетия, Алагирский р-н), Армении и Дагестане на высоте более 1500 м. В настоящей работе были изучены 19 штаммов ризобий из клубеньков 10 растений вавиловии, принадлежавших к трем разным популяциям.

Штаммы ризобий изолировали из клубеньков V. formosa с исполь- зованием стандартной методики (12). Из каждого клубенька получали по одному штамму, который выращивали на питательной среде ¹ 79 (13) при 28 °С. Все изоляты были депонированы в Ведомственную коллекцию полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) и хранятся на станции низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов при -80 °С («Liconic Instruments», Лихтенштейн) (14). Информация об этих штаммах доступна online в базе данных ВКСМ .

Для филогенетического анализа из штаммов ризобий выделяли геномную ДНК по стандартному протоколу (15) и амплифицировали фрагмент ITS (intergenic transcribed spacer) длиной 1000-1300 п.н. с помощью праймеров FGPS1490-72 5'-TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3' и FGPL132'-38 5'-CCGGGTTTCCCCATTCGG-3' (16, 17), а также фрагмент гена nodA длиной 666 п.н. с помощью праймеров nodA-1 5'-GCRGTGGAARNTRN-NCTGGGAAA-3' и nodA-2 5'-GGNCCGTCRTCRAASGTCARGTA-3' (18). ПЦР проводили в объеме 25 мкл, содержащем 150 мкМ смеси dNTPs («Heli-con», Россия), 1 ед. Taq-полимеразы («Евроген», Россия), по 10 пМ каждого из праймеров, а также по 10-20 нг очищенной ДНК в качестве матрицы. Амплификацию осуществляли на автоматическом амплификаторе T100 («Bio-Rad», США) при следующем температурном режиме: стартовая денатурация — 2 мин при 95 °С; 35 циклов денатурации — 30 с при 94 °С, 30 с отжига при 50 °С (праймеры FGPS1490-72/FGPL132'-38) или 49 °С (праймеры nodA-1/nodA-2), 1 мин элонгации при 72 °С; финальная элонгация — 3 мин при 72 °С. Результаты ПЦР визуализировали с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле («Amresco», США) в 0,5½ TAE, маркер молекулярной массы — ДНК-маркер 100 bp + 1,5 Kb + 3 Kb («Сибэнзим», Россия). Очистку ПЦР-продуктов проводили согласно стандартной методике (19). Последовательности ITS и гена nodA секвенировали на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl («Applied Biosystems», США), для их первичной обработки применяли программу UGENE («Unipro», Россия) (20). Для полученных последовательностей были найдены схожие последовательности из баз данных GeneBank при помощи анализа BLAST (Basic logical alignment search tool) в NCBI (National Center for Biotechnology Information, . На основе этих данных с использованием метода ближайших соседей в программе MEGA v. 5.0 были сконструированы два филогенетических дерева (21). Для оценки эволюционных расстояний использовали метод p-distance, для статистической поддержки кластеров — метод bootstrap с 1 тыс. реплик.

Наличие гена nodX в изолятах проверяли с помощью ПЦР с праймерами oMP199-F 5'-CCATGGGACCATCCAATGAAC-3' и oMP196-R 5'-TTAAGCGACGGAAAGCCTTC-3' (22). Состав реакционной смеси и температурный режим были аналогичны описанным выше, за исключением температуры отжига, равной 53 °С. В качестве положительного контроля использовали штамм R. leguminosarum bv. viciae A1 (22), обладающий способностью формировать клубеньки на афганских формах гороха.

Для последовательностей фрагментов ITS и гена nodA вычисили генетические расстояния как внутри разных таксономических и географических групп ризобий, так и между ними. Сравнение генетических расстояний для последовательностей ITS и nodA проводили между двумя разными наборами групп микроорганизмов. Это корреляция штаммов R. legu-minosarum bv. viciae (ризобии из гороха), R. leguminosarum bv. trifolii (ризо-бии из клевера) и исследуемых штаммов с растением-хозяином, а также корреляция изолятов из вавиловии с их географическим происхождением.

Были проведены как внутри-, так и межгрупповые сравнения генетических расстояний. Генетические расстояния оценивали по параметру p-distance в программном пакете MEGA v. 5.0 (21).

Результаты . Фрагменты ITS удалось амплифицировать и секвени-ровать полностью или частично для всех изученных штаммов, при этом у изолятов из Дагестана в геноме оказалось как минимум две разные копии рибосомального оперона, содержащие фрагменты ITS разного размера. На дендрограмме, построенной на основе секвенирования ITS (рис. 1), эти последовательности помечены литерами l (long) и s (short).

В таблице 1 указаны длины полученных фрагментов и их сходство с ITS трех типовых штаммов внутри вида R. leguminosarum , один из которых (штамм ТОМ) содержит ген nodX . Геномы этих штаммов секвениро-ваны и доступны online в базе данных NCBI. Примечательно, что по ITS основная часть штаммов, выделенных из вавиловии, обладает большим сходством с биоваром viciae , чем с биоваром trifolii : средние коэффициенты сходства с последовательностями типовых штаммов составляли 83±0,9 % для штамма 3841, 89±0,8 % — для ТОМ и лишь 80±1,0 % — для WSM2304.

1. Происхождение изолятов из клубеньков вавиловии прекрасной Vavilovia formosa (Stev.) Fed. и сходство последовательностей их ITS-фрагментов с последовательностями референтных штаммов из баз данных GenBank

Штамм	¹ растения	Длина фрагмента ITS, п.н.	Сходство с последовательностями типовых штаммов, %
			Rhizobium legumino-sarum bv. viciae 3841	Rhizobium legumino-		Rhizobium leguminosa-rum bv. trifolii WSM2304
				sarum bv.	viciae TOM
			Северная Осетия
Vaf-01	1	565	96		86	90
Vaf-09		613	75		90	75
Vaf-10	3	1206	83		95	81
Vaf-12		1184	85		89	88
Vaf-23	4	565	99		88	100
Vaf-25		649	80		99	72
Vaf-26	5	1113	91		94	91
			Армения
Vaf-45	7	1199	82		93	80
		1010	78		90	79
Vaf-72		1199	82		93	80
		1010	78		90	79
Vaf-46	8	1199	82		93	80
		1010	78		90	79
Vaf-51		1199	82		93	80
		1010	78		90	79
			Дагестан
VD1/1k	1D	1105	92		86	87
VD1/9m		1287	86		94	75
VD3/2(1)	3D	1032	82		83	77
VD3/7k		1032	82		83	77
VD6/12k	6D	1032	82		83	77
VD6/13m		1032	82		83	77
VD7/1	7D	1032	82		83	77
VD7/20m		1032	82		83	77

ITS-дендрограмма показывает, что все исследуемые штаммы относились к семейству Rhizobiaceae и попадали в две группы бактериальных видов, несущие разные типы рибосомального оперона (кластеры I и II). Причем принадлежность к одной или другой группе не зависела от вида штамма или географического распространения. Виды R. leguminosarum bv. viciae , R. leguminosarum bv. trifolii , R. etli присутствовали в обеих группах, как и разные изоляты из вавиловии прекрасной армянского и дагестанского происхождения. Возможно, такое деление было обусловлено наличием лишь нескольких типов хромосом, обеспечивающих адаптацию к среде и жизнеспособность бактерии.

Штаммы ризобий, выделенные из клубеньков вавиловии, не фор-

VD3/2(1) VD3/7k

99 VD6/12k VD6/13m VD7/1 VD7/20m Vaf-45s Vaf-51s Vaf-72s Vaf-46s

---Mesorhizobium sp. WSM4349

• -    Bradyrhizobium japonicum USDA 6

Bradyrhizobium sp. BTAil

---Sinorhizobium mediate WSM419

----Sinorhizobium meliloti 2011

• —    Sinorhizobium fredii USDA 257

----Rhizobium leguminosarum bv. viciae 248 ------------Rhizobium sp. LPU83 ----------Rhizobium etli CFN 42

Rhizobium leguminosarum bv. viciae WSM1455

—Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM2012

• - Rhizobium gallicum bv. gallicum R602                /

  --------Neorhizobium galegae bv. officinalis НАМ ВI A Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM597 -Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM2304 ■Rhizobium etli bv. mimosae Mimi

Vaf-451

Vaf-461

Vaf-721

Vaf-511

2i *-VDl/lk ___iVaf-01 WVaf-12

62г Rhizobium leguminosarum bv. viciae TOM*

87J-Vaf-25

65 1 VDl/9m

| Северная Осетия ^ Дагестан

I

II

Северная Осетия

------Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM2297

—Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 4292

^—Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841

20[

-Rhizobium leguminosarum bv. viciae WSM1481

■iRhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM1325

Vaf-26

Vaf-23

^j Северная Осетия

0,05

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное с использованием метода ближайших соседей на основе фрагмента последовательности ITS (758 п.н.) и отражающее таксономическое положение исследованных штаммов ризобий из клубеньков вавиловии прекрасной ( Vavilovia formosa (Stev.) Fed.) разного географического происхождения. На ветвях указаны значения bootstrap > 45 (1000 реплик). I, II — статистически достоверные кластеры. Звездочкой помечен штамм-носитель гена nodX ; s (short) и l (long) — штаммы из Армении, несущие две разные копии фрагмента ITS. Жирным шрифтом выделены изученные штаммы.

мировали отдельного кластера, но распадались на группы. По составу этих групп можно было судить о тенденции изучаемых изолятов к географической изоляции. Все штаммы из Армении, а также 6 из 8 штаммов из Дагестана образовывали кластеры с высокой статистической поддержкой (> 82 %) и входили в I группу. Фрагменты ITS штаммов вавило-вии из Северной Осетии встречались только во II группе, и эти штаммы объединялись со штаммами из своего региона (Vaf-01 и Vaf-12, Vaf-09 и

Vaf-10, Vaf-23 и Vaf-26). Исключением стал штамм Vaf-25, который образовывал одну группу со штаммами VD1/9m из Дагестана и R. leguminosa-rum bv. viciae TOM (носителем гена nodX ) при уровне поддержки 87 %. Подобная кластеризация была показана ранее только для изолятов из Северной Осетии (8). В связи с этим мы проверили изоляты из регионов Дагестана и Армении на наличие гена nodX (рис. 2). Все они оказались носителями этого гена.

Рис. 2. Результат ПЦР анализа североосетинских (А) , армянских (Б) и дагестанских (В) изо-лятов ризобий из клубеньков вавиловии прекрасной Vavilovia formosa (Stev.) Fed. с праймерами omP196/omP199 : 1 — Vaf-01, 2 — Vaf-09, 3 — Vaf-10, 4 — Vaf-12, 5 — Vaf-23, 6 — Vaf-25, 7 — Vaf-26, 8 — Vaf-45, 9 — Vaf-72, 10 — Vaf-46, 11 — Vaf-51, 12 — VD1/1k, 13 — VD1/9m, 14 — VD3/2(1), 15 — VD3/7k, 16 — VD6/12k, 17 — VD6/13m, 18 — VD7/1, 19 — VD7/20m. Контроль (К) — ДНК штамма Rhizobium leguminosarum bv. viciae А1. Маркеры молекулярной массы (М) — MassRuler (Thermo Scientific, США) (А) и 100 bp + 1,5 Kb + 3Kb («Сибэнзим», Россия) (Б, В).

Важно отметить, что последовательность ITS, которая представляет коровую часть генома, дает нам понимание только таксономической принадлежности изучаемых штаммов. Вопрос о хозяйской специфичности ри-зобий можно решить, изучая гены, вовлеченные в образование бобово-ризобиального симбиоза. К ним относятся гены из nod оперонов (23). В нашем исследовании мы рассматриваем ген nodA , который, хоть и не участвует в непосредственном контроле специфичности симбиоза, сцеплен с генами, кодирующими эти факторы специфичности. Преимущество использования именно этого гена заключается в том, что в геномах ризобий он представлен только одной копией (18).

Дендрограммы, построенные на основе последовательностей ITS-региона и гена nodA , существенно различались между собой (рис. 1, 3). На nodA -дендрограмме все исследуемые изоляты формировали единый кластер при уровне поддержки 100 % со штаммами, принадлежащими R. leguminosarum bv. viciae , что позволяет отнести их к группе перекрестной инокуляции гороха. На основании анализа гена nodA внутри этого кластера изоляты были разделены на три группы, не соответствующие ITS-группам. Так, изоляты из Северной Осетии и Дагестана совместно сформировали группы I и III, а Армянские изоляты вошли только в группу II (см. рис. 3). Стоит отметить, что на nodA -дендрограмме штамм R. legumi-nosarum bv. viciae TOM оказался наиболее близкородственным по отношению к изучаемым изолятам. Еще одна немаловажная особенность, позволяющая судить об обособленности изучаемой группы штаммов, состоит в том, что во всех трех кластерах, содержащих изоляты из вавиловии, отсутствовали штаммы из других таксономических групп.

По данным сравнения фрагментов ITS, связь с хозяйской специфичностью у разных групп ризобий не прослеживалась, поскольку значения внутригрупповых и межгрупповых генетических расстояний достоверно не различались (табл. 2). Напротив, можно делать выводы о тенденции 660

к географической изоляции изучаемых микросимбионтов вавиловии.

IQOl

loot

XQQ] Bradyrhizobium japonicum USDA 6 ' Bradyrhizobium sp. CCBAU 41267

---------Mesorhizobium sp. WSM4349

\Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 4292 ^^Rhizobium etli CFN 42

-Rhizobium gallicum bv. gallicum R602

--------------Neorhizobium galegae bv. officinalis НАМ ВI

BOI Sinorhizobium meliloti 2011

---Sinorhizobium medicae WSM419

—Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM2297

—Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM2012

—Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM1325

-----Rhizobium leguminosarum bv. trifolii SVSM597

----Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM2304

12\Bbizobium leguminosarum bv. viciae WSM1481

100 'Rhizobium leguminosarum bv. viciae WSM1455 \Rhizobium leguminosarum bv. viciae 248

VyRhizobium leguminosarum bv. viciae 3841

---Rhizobium leguminosarum bv. viciae TOM*

Vaf-23

Vaf-26

Vaf-10

Vaf-09

__Vaf-01

100 VD7/20m

VD7/1

VD6/13k

VD3/2m

VD6/12m

Vaf-46

Vaf-45

Vaf-72

Vaf-51

Vaf-12

VDl/9m

100 VDl/lk

-Vaf-25

I

II

III

0,05

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное с использованием метода ближайших соседей на основе частичной последовательности гена nodA (531 п.н.) и отражающее таксономическое положение исследованных штаммов ризобий из клубеньков вавиловии прекрасной Vavilovia formosa (Stev.) Fed. разного географического происхождения. На ветвях указаны значения bootstrap > 45 (1000 реплик). I, II, III — статистически достоверные кластеры. Звездочкой помечен штамм-носитель гена nodX . Жирным шрифтом выделены изученные штаммы.

2. Генетические расстояния по последовательностям ITS и nodA у ризобий, выделенных от разных растений-хозяев в различных географических регионах

Штаммы, происхождение	Генетические	расстояния
	ITS	nodA
Корреляция последовательносте	й ДНК с растение	м-хозяином
Сравнения внутри групп:
из вавиловии ( Rhizobium leguminosarum bv. viciae )	0,082±0,008	0,036±0,005
из гороха ( Rhizobium leguminosarum bv. viciae )	0,115±0,010	0,016±0,003
из клевера ( R. leguminosarum bv. trifolii ) Межгрупповые сравнения:	0,089±0,008	0,119±0,010
вавиловия—горох	0,096±0,008	0,045±0,006
вавиловия—клевер	0,099±0,008	0,252±0,015
горох—клевер	0,100±0,008	0,254±0,016

Продолжение таблицы 2

Корреляция последовательностей ДНК c географическим происхождением
Сравнение внутри групп: Армения	0,000±0,000	0,001±0,001
Дагестан	0,054±0,007	0,040±0,005
Северная Осетия	0,050±0,006	0,040±0,005
Межгрупповые сравнения: Армения—Дагестан	0,116±0,012	0,039±0,006
Армения—Северная Осетия	0,060±0,007	0,039±0,006
Дагестан—Северная Осетия	0,111±0,011	0,034±0,005

В то же время при сравнении генетических расстояний по гену nodA выявлялись четкие корреляции с хозяйской специфичностью, однако связь с географическим происхождением изолятов вавиловии отсутствовала. Поскольку ген nodA не участвует в контроле хозяйской специфичности (он кодирует общий для всех ризобий этап синтеза Nod-фактора — присоединение жирнокислотного остатка к олигохитиновой цепи), данная корреляция может быть обусловлена сцеплением nodA с генами хозяйской специфичности (эти гены образуют на Sym -плазмидах R. leguminosarum компактные кластеры размером около 20 т.п.н.). Полученные корреляции, по всей видимости, отражают наличие высокоспецифичных взаимодействий каждой группы штаммов R. leguminosarum со своими растениями-хозяевами.

Несовпадение дендрограмм, построенных по nodA и ITS, позволяет предположить, что находящиеся на плазмидах nod -гены могут активно переноситься в популяциях R. leguminosarum , обеспечивая свободное комбинирование бактериальных генов специфичности к вавило-вии и различных вариантов хромосом у штаммов биовара viciae , а в некоторых случаях и биовара trifolii (последнее подтверждается 100 % сходством ITS-локуса одного из изолятов вавиловии с типовым штаммом WSM2304 и соответствует ранее опубликованным данным о возможности активного переноса Sym -плазмид между этими биоварами в природных популяциях).

Таким образом, на основании данных по последовательности ITS показано, что все изученные штаммы ризобий, выделенные из клубеньков вавиловии прекрасной, принадлежат к виду Rhizobium leguminosarum . Принимая во внимание результаты филогенетического анализа локуса ITS, а также гена nodA , можно утверждать, что эти штаммы относятся к биовару viciae . Согласно представленным генетическим расстояниям, все они образуют статистически обособленную группу, внутри которой прослеживается тенденция к географической изоляции и узкой хозяйской специфичности. Формирование обособленных от других штаммов R. legumi-nosarum bv. viciae кластеров, а также наличие гена нодуляции афганского гороха nodX у всех изолятов, выделенных из Vavilovia formosa , могут послужить основой для дальнейшего изучения этой группы клубеньковых бактерий и ее возможного выделения в обособленную таксономическую группу внутри вида R. leguminosarum.