Филогенетический анализ структур ADAMTS-4 и ADAMTS-5

DOI:

Citation. Korchagina A.A., Krylov P.A. Philogenetic Analysis of ADAMTS-4 and ADAMTS-5 Structures. Natural Systems and Resources, 2020, vol. 10, no. 1, pp. 5-11. (in Russian). DOI:

Цитирование. Корчагина А. А., Крылов П. А. Филогенетический анализ структур ADAMTS-4 и ADAMTS-5 // Природные системы и ресурсы. – 2020. – Т. 10, № 1. – С. 5–11. – DOI:

Введение. ADAMTS-4 и -5 являются внеклеточными протеолитическими фермента-ми-аггреканазами, которые действуют на агг-реканазы, разрушая их и тем самым давая начало развитию остеоартроза.Структурные особенности и ферментативная активность данных ферментов на данный момент достаточно хорошо изучена [7; 10]. Известно, что ADAMTS-4 содержит 7 доменных участков: сигнальная область, продомен, каталитический домен, дезинтегринподобный домен, мотив тромбосподина, богатый цистеином домен и спейсерный участок [3; 4]. ADAMTS-5 содержит все те же домены, плюс у него есть еще один дополнительный мотив тромбосподина в конце [2; 11]. Однако изменения структур в ходе эволюции в настоящее время остается нерешенным вопросом. Изучение в данном направлении позволит определить зависимость структурных изменений и их функциональных и ферментативных характеристик в процессе эволюционного развития.

Для изучения данных аггреканаз проводятся исследования in vivo на различных организмах. В частности на мышах, кроликах и крысах. Однако их структуры отличаются от человеческих. В работе H.J. Kosasih и соавторов были описаны исследования по ингиби- рованию ADAMTS-4 и -5, которые проводились на мышах. Оказалось, что они более подвержены к действиям ADAMTS-4, а ингибирование последнего приводило практически к полной остановке разрушения аггре-кана, не смотря на то, что фермент ADAMTS-5 продолжал работать [1]. У человека же в большей степени играет роль либо ADAMTS-5, либо оба эти фермента [1; 6; 8]. В таком случае, проводить эксперименты на мышах является не таким уж эффективным способом изучения данных ферментов и перенос результатов на человеческую модель может оказаться не достоверным. Цель исследования – провести филогенетический анализ ADAMTS-4 и -5 у различных организмов и выявить структурно-функциональные различия.

Материал и методы. Для построения эволюционных деревьев была использованная программа MEGA X (Pennsylvania State University, USA). Для определения эволюционных различий в структуре были взяты последовательности разных семейств, критерием отбора была относительно равная длина последовательностей и схожесть структур. Исходные данные для построения филогенетических деревьев были представлены в фор- мате .fasta из открытой базы данных NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA). Для подбора последовательностей было проведено множественное выравнивание с помощью программного пакета ClustlO (University College Dublin, Irish). Организмы подбирались из разных семейств таким образом, чтобы можно было проследить изменение структур в ходе эволюций. Изначально были выбраны организмы из ряда семейств: Насекомые, Рыбы, Амфибии, Пресмыкающиеся, Птицы и Млекопитающие.

При проведении множественного выравнивания было определено, что структуры насекомых сильно отличаются и поэтому было принято решение не использовать последовательности организмов данного семейства. В итоге были выбраны данные структуры: Лосось ( Salmosalar ), Цесарка ( Numidameleagris ), Лягушка ( Xenopus-tropicalis ), Питон ( Pythonbivittatus ), Кролик ( Oryctolaguscuniculus ), Леопард ( Acinonyx-jubatus ), Горилла ( Gorillagorilla ), Человек ( Homosapiens ).

Филогенетические деревья белков ADAMTS-4 и -5 были созданы методом максимального правдоподобия на основе матричной модели JTT. Начальное дерево консенсуса, выведенное из 1 000 повторностей, было взято для представления эволюционной истории анализируемых таксонов. Эволюционный анализ был проведен в программе MEGA X. Начальное дерево для эвристического поиска было получено автоматически путем при- менения алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ к матрице попарных расстояний, оцененных с использованием модели JTT, и затем выбора топологии с более высоким значением логарифмической вероятности. Дерево построено в масштабе с длиной ветвей, измеренной числом замен на сайт.

Для определения наиболее подходящего для проведения экспериментов организма были выбраны животные с наименьшими изменениями в последовательности и возможностью использования для экспериментов. Построение деревьев по данным последовательностям также происходило по методу максимального правдоподобия. Для проверки были выбраны данные организмы: Бык ( Bostaurus ), Верблюд ( Camelusferus ), Свинья ( Susscrofa ), Осел ( Equuscaballus ), Кролик ( Oryctolaguscuniculus ), Крыса ( Rattusnorvegicus ), Мышь ( Musmusculus ), а также Человек ( Homosapiens ). Параллельно с построением филогенетических деревьев проводилось множественное в программе ClustlO (University College Dublin, Irish) выравнивание последовательностей, для обнаружения связей между структурными элементами и эволюционными изменениями.

Результаты и обсуждение. Ниже представлено эволюционное дерево по ADAMTS-4 (рис. 1). Наиболее близкими к человеческой как по структуре, так и эволюционно, являются белки гориллы и кролика (черные круги). Леопард является менее схожим по структуре белком

|)Щ

Пй [(6) 5(4076173 3|ATS4 HUMA/i-1-837 Человек 3 *

ПИ П(5)ХР 004027797 1/1-837 Горилла 3 •

П*1

. 1---(4) ХР 002715217 1Л -851 Кролик ]<

—(3)ХР 026904439 1Л 834 Леопард J О

(7) ХР 004919795 1Л-852 Лягуцма 3 <>

—(8) ХР 007426188 1/1-830 Литон ] О

------(1 )ХР 021254651 1/1-833 Цесарка 3

(2)ХР 014017966.1/1-837 Лосось 3

Рис. 1. Эволюционное дерево ADAMTS-4:

черный круг – организмы с наибольшим сходством; белый круг – сходство меньше по отношению к человеку; ромб – значительные отличия по отношению к человеку

(белый круг). У лягушки и питона есть заметные отличия (белый ромб). Структуры цесарки и лосося сильно разнятся с человеческой.

При проведении множественного выравнивания было также заметно, что наибольшая разница в структурах различных последовательностей находится в самом начале в районе сигнальной области и продомена [5; 9]. Если не брать во внимание большие отличия в структурах лосося и цесарки в сравнении с остальными, то срединные участки, так же, как и концевые в ходе эволюции не сильно изменились. Это означает, что наиболее важные для работы данного фермента доменные участки, следующие за продоменом, сохранились почти не тронутыми. Продомен необходим для перехода фермента в активное состояние и именно его структура отличается во всех последовательностях [12].

Далее исследуем ADAMTS-5. Ниже представлены результаты по построению филогенетических деревьев (рис. 2).

Результаты данного филогенетического древа являются схожими с результатами ADAMTS-4. Наиболее близкие горилла и кролик (черные круги) и наименее схожие по структуре и самые далекие эволюционно это лосось и цесарка.

Изучение структур после множественного выравнивания так же показало различие в самом начале в районе сигнальной области и продомена. Структуры, идущие за ними, имеют незначительные отличия.

Филогенетические деревья,построен-ные по последовательностям возможных экспериментальных животных (см. рис. 3, 4). По данным деревьям видно, что ближайшими к человеку организмами являются кролик, крыса и мышь – три самых распространенных экспериментальных животных. По наиболее схожим структурным характеристикам и ближайшему расположению на филогенетическом древе можно понять, что наиболее подходящим организмом будет являться кролик. Однако во многих исследованиях ADAMTS-4 и -5 основными подопытными были мыши.

Как уже говорилось ранее, ферментативная активность ADAMTS-4 и -5 различается у организмов. У мышей ADAMTS-4 в большей степени участвует в развитии остеоар-тоза. По результатам филогенетического анализа это может быть связано с продоменом, а точнее с пропротеин-конвертазой, которая активирует фермент, связываясь с участком продомена. У мышей возможно больше про-протеин-конвертаз, которые распознают и активируют именно ADAMTS-4, у человека возможно наоборот, или же у него пропротеин-конвертазы в одинаковой степени распознают обе формы ADAMTS [4]. В таком случае в будущем имеет смысл провести исследования в области активации ADAMTS-4 и -5 для подтверждения или опровержения данной теории. Полученные результаты характерны для обоих видов аггреканаз.

03] i

(8) sp|O9UNA0 2JATS5 HUMAN/1-930 Человек

• (7)    XP 004062693 1/1-930 Горилла 3 Ф

  
  
  

  M_ H6)XP 002716821 1/1-931 Кролик J •

  —(5) XP 026897564 1/1-930 Леопард 1 О

  ----(4)XP 007430226 1/1-927 Питом J О

  (3)XP 0029357401/1-913 Лягушка 3 О

  (2) XP 0140067991/1-956 Лосось J

  (1)XP 021256255.1/1-993 Цесарка J

i-------------------------------------1

azo

Рис. 2. Эволюционное дерево ADAMTS-5:

черный круг – организмы с наибольшим сходством; белый круг – сходство меньше по отношению к человеку; ромб – значительные отличия по отношению к человеку

(4) W 8580531(1Л08 Бь*

па

па

па

(В) ХР 003481462 2/1.872 Секея

ПН

(8} EPY89006U1 07 6ер6«еад

пч

(Г) NP ООнМТв» 2/1 «37 Осел

А (5) spto?5173 3JATS4 HUMAN'1-837 Чопике

А (3)ХР 002715217 171-851 Крепи

Н

• V 1) NP 076449 171-851 Крыса

Д <2> SriO6BHJ2 21ATS4 UOUSE'1 433 Мышь

Рис. 3. Филогенетическое дерево ADAMTS-4:

черный треугольник – организмы с наибольшим сходством;

белый треугольник с вершиной вверх – второй по сходству к последовательности человеческого белка; белый треугольник с вершиной вниз – третий по сходству к последовательности человеческого белка

• (5)    HP 0011599671/1-934 Бык

ПО

пз)

• (6)    ХР 020926524.171 -929 Cewefl

(В) ХР 010975689 2/1-930 Вербгеод

(7) ХР 023485737.1/1-929 Осел

-------- ♦ (4)srtQ9UNA02|ATS5HIUI

• (3)ХР 002716821 1/1-931Kpof*w

|5|

............... О (2) NP 035912 2/1-930 Мышь — О (1) HP 942056 171-928 Крыса

»<Л0

Рис. 4. Филогенетическое дерево ADAMTS-5:

черные кружки – организмы с наибольшим сходством;

белый ромб – второй по сходству к последовательности человеческого белка; белый круг – третий по сходству к последовательности человеческого белка

Заключение. В данном исследовании было обнаружено, что наиболее подходящим опытным организмом является кролик, а не мыши, которые более часто используются в экспериментах. Также стало понятно, что структурные различия, образовавшиеся в ходе эволюции, небольшие и находятся преимущественно в самом начале последовательностей в районе сигнальной области и продомена. На этом основании можно пред- полагать, что пропротеин-конвертазы, активируя в разной степени ADAMTS-4 и -5, также играют роль в развитии остеоартроза у человека.