Филогенетическое положение галотолерантного штамма Brevibacterium sp. U1, выделенного из засоленной почвы, в системе рода Brevibacterium

Представители рода Brevibacterium семейства Brevibacteraceae класса Actinobacteria, выделены из молокосодержащих продуктов, включая сыры, встречаются у людей и птиц в качестве комменсалов или условно-патогенных микроорганизмов; населяют морские и почвенные экосистемы [Ivanova et al., 2004]. Особое внимание исследователи уделяют ассоциированным с созреванием сыра бревибактериям. Поскольку в процессе производства сыров их поверхность солят или погружают в насыщенный рассол, изучена осмоадапация бревибактерий к условиям высокой осмолярности внешней среды. На примере биотехнологически значимого вида B. linens было показано, что преобладающим осмопротектором является эктоин [Bernard et al., 1993].

Последующее изучение геномов представителей рода Brevibacterium показало наличие генов, кодирующих биосинтез эктоина у большинства исследованных видов, за исключением видов, ассоциированных с человеком [Pham et al., 2017]. В других работах выявлена колинеарность эволюционных расстояний между нуклеотидными последовательностями 16S рДНК и аминокислотными последовательностями ферментов синтеза эктоина близкородственных организмов (эволюционное расстояние менее 0.15) [Cai et al., 2011; Widderich et al., 2014].

Ранее из почвы района солеразработок Верхнекамского месторождения солей был выделен гало-толерантный грамположительный бактериальный штамм U1, способный к активному росту по сравнению с другими исследованными в этой работе штаммами в полноценной среде Раймонда в присутствии 12%-ного NaCl. На основе морфологиче-

ских характеристик штамм был отнесен к роду Brevibacterium [Плотникова и др., 2006].

Цель настоящей работы – определение филогенетического положения штамма Brevibacterium sp. U1 в системе рода Brevibacterium на основе анализа последовательностей 16S рДНК и генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования

Brevibacterium sp. U1 был выделен из почвы района солеразработок Верхнекамского месторождения солей [Плотникова и др., 2006].

Среды и условия культивирования

Минеральная среда Раймонда (г/л деионизированной воды): NH4NO3 - 2.0, MgSO4 × 7H2O - 0.2, KH2PO4 - 2.0, Na2HPO4 - 3, CaCl2 × 6H2O - 0.01, Na2CO3 - 0.1, pH - 7.0 [Raymond, 1961].

Агаризованная богатая среда Раймонда следующего состава (г/л среды Раймонда): триптон - 5, дрожжевой экстракт - 2.5, NaCl - 30, агар - 15.

Культивирование штамма проводили на агари-зованной богатой среде Раймонда в термостатируемом шкафу ТС-1/80 СПУ (Россия) при температуре 28оС.

Молекулярно-генетические и биоинформационные методы исследования

Геномную ДНК из бактериальных клеток выделяли SDS-CTAB методом [Wilson, 1995].

С препаратов ДНК амплифицировали фрагмент гена 16S рРНК согласно методике, описанной ранее [Anan’ina et al., 2011].

Амплификацию и детекцию ect -генов на матрице ДНК выполняли, используя систему праймеров G2F/G2R согласно протоколу, описанному в статье [Ананьина, Шестакова, Плотникова, 2018].

Секвенирование генов проводили с помощью соответствующих праймеров и Big Dye Terminator Ready Reaction Kit v3.1 («Thermo Fisher Scientific», «Fisher Scientific», США), следуя инструкциям фирмы-производителя на приборе Genetic Analyzer 3500xl в лаборатории молекулярной биологии и генетики при кафедре ботаники и генетики растений ПГНИУ.

Биоинформационное обеспечение

Сервис публичной базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) – Blastn . Пакет программ Mega v. 5.0, позволяющий выравнивать нуклеотидные последовательности, рассчитывать эволюционные расстояния с последующим графи- ческим представлением результатов.

Результаты и обсуждение

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК длиной 1425 п.н. штамма Brevibacterium sp. U1 с помощью программы Blastn выявил высокий уровень сходства с нуклеотидными последовательностями генов представителей рода Brevibacterium, что подтвердило результат предварительной идентификации штамма на основе морфо-физиологических характеристик. На филогенетическом дереве штамм входил в кластер Brevibacterium sensu stricto, формируя подкластер с видами B. aurantiacum и B. antiquum, уровень сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК составил 99.29 и 97.8%, соответственно. Следует отметить, что уровень 16S рДНК сходства между видами кластера Brevibacterium sensu stricto находился в пределах 93.5-99.2%. Максимальное значение сходства 99.2% отмечено между видами B. linens и B. iodinum. Таким образом, уровень сходства штамма Brevibacterium sp. U1 и представителя вида B. aurantiacum сопоставим с межвидовым для группы Brevibacterium sensu stricto (рис. 1). Кроме того, типовой штамм вида B. aurantiacum VKM Ac-2111Т был выделен из сыра сорта Camambert . Современное исследование показало доминирование представителей вида B. aurantiacum в пяти различных сырах, созревающих в рассоле [Cogan et al., 2014]; в то время как исследуемый штамм Brevibacterium sp. U1 был выделен из засоленной почвы, загрязненной отходами соледобывающего предприятия [Плотникова и др., 2006]. Принимая во внимание вышесказанное, становится очевидной необходимость дополнительного исследования для уточнения таксономического (филогенетического) положения штамма Brevibacterium sp. U1 с применением других генов.

Использование разработанной нами ранее системы праймеров [Ананьина, Шестакова, Плотникова, 2018] позволило получить ПЦР-продукт ожидаемой длины около 800 п.н., включающий фрагменты ectB- и ectC-генов, на ДНК-матрице исследуемого штамма Brevibacterium sp. U1. Предварительный скрининг в публичных базах данных нуклеотидной последовательности фрагмента ect-оперона с помощью программы Blastn выявил его гомологию с ect-генами бактерий рода Brevibacterium.

В настоящее время только у 6 из 15 видов группы Brevibacterium sensu stricto представлены нуклеотидные последовательности ect-генов в публичной базе данных Национального центра биотехнологической информации США. Уровни сход- ства нуклеотидных последовательностей ectB-и ectC-генов типовых штаммов видов группы Brevibacterium sensu stricto находились в пределах 64.2-93.2 и 74.6-97.6%, соответственно. Результаты свидетельствуют о более высоком уровне дивергенции ect-генов по сравнению с геном 16S рРНК (рис. 2а, б). При этом ectC-ген имел меньшие значения эволюционного расстояния между видами группы Brevibacterium sensu stricto, чем ectB-ген (рис. 2а, б). Наиболее высокий уровень сходства нуклеотидных последовательностей ectB-и ectC-генов, 97.3 и 94.3%, соответственно, исследуемый штамм проявил с видом B. aurantiacum (рис. 2а, б). Примечательно, что значение сходства нуклеотидной последовательности ectB-гена штамма U1 было выше уровня межвидового сход- ства. В то время как для ectC-гена это значение находилось в вычисленном интервале, а на филогенетическом дереве штамм формировал отдельную ветку в группе B. aurantiacum/ B. antiquum (рис. 2б). При этом положение видов относительно друг друга в кластере Brevibacterium sensu stricto на «ectB»- и «ectC»-деревьях отличалось, что может быть следствием горизонтального переноса генов. Современные исследования геномов штаммов, близкородственных виду B. aurantiacum, выявили большое количество транспозаз и интеграз, а также фрагменты гомологичных последовательностей ДНК, что предполагает горизонтальный перенос генов, который, по мнению авторов, обеспечивает приспособление к условиям экологической ниши [Levesque et al., 2019].

-----------UI

"B. aurantiac™ (X76566.1)

-----B. anftguum VKM Ac-2118* (AY243344.1)

-B. marinum HFW-26^Y(AM4218071)

_rB. picturae LMG 22061¹ (AJ620364.1)

¹--------------------------B. sandarakinum 01-Je-003^x (FN293377.1)

В. секте KMM 3637* (AY228463.1)

B. casei DSM 20657* (AJ251418.1)

----------------B. ammonubficum Al* (JF937067.1)

B. ocean! BBH7*(AM158906.2)

---------------------------------В. slhguriense МВ18*(АМ937247.2)

--------В. epidermidis NCDO 2286* (Х76565.1)

----В. permense VKM Ac-2280¹ (AY243343.1)

-В. sedimims CGMCC 1.15472’ (KX356313.1)

йюДпшп (X83813.1)

Рис. 1 . Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S рДНК с использованием метода «ближайшего соседа»; масштаб соответствует 1 замене на каждые 100 нуклеотидов

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов (а) ect B и (б) ect C с использованием метода «ближайшего соседа»; масштаб соответствует 1 замене на каждые 100 нуклеотидов

Заключение

Полученные в ходе исследования данные выявили высокий уровень сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина, штамма Brevibacterium sp. U1 с видом B. aurantiacum. Тем не менее, выявлено значительное эволюционное расстояние нуклеотидных последовательностей ectC-гена исследованного штамма и близкородственного вида B. aurantiacum. В связи с вышеска- занным можно предположить, что исследуемый штамм может быть представителем нового вида.

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: 01201353247.