Физико-химические исследования высвобождения биологически активных веществ из маклюра оранжевая

Настойка маклюры применяется наружно при лечении следующих болезней: полиартрит, подагра, отложение солей, радикулит, наличие шпор. Растирают настойкой 2-3 раза в день[4,6].

Настойку маклюры принимают внутрь при раке предстательной железы, легких, горла, губ, при других опухолях. При раке кости, крови, при суставных заболеваниях. Настойка маклюры считается хорошим средством для рассасывания как злокачественных, так и доброкачественных опухолей (мастопатии, миомы, фибромиомы и др.). Принимают настойку маклюры внутрь при злокачественных опухолях длительно, а при доброкачественных - в течение 3 месяцев (иногда более). [4,5]

Внутрь настойку применяют в гомеопатических дозах методом наращивания. Первую неделю начинают с 3 капель за раз 1 раз в день до еды. 2-я неделя - по 2 раза в день; 3-я неделя - 3 раза в день. Затем каждую неделю увеличивают в один из приемов на 1 каплю. Обычно к 30 неделе доводят до 30 капель за прием по 3 раза в день. Затем идет снижение дозы каждую неделю на 1 каплю за один прием. [3]

Для получения масляного извлечения из маклюры резанные соломкой плоды закладывают в банку доверху и заливают растительным маслом. Затем через 1 неделю сливают и сильно отжимают остаток. Применяют при аденомах и полипах носа. Нос при этом хорошо очищают и закладывают турунды с маслом маклюры. При ушных болях его закапывают в ухо по 3-5 капель. [4,6,7]

Материалы и методы.

• 1.    Соплодие маклюры представляет собой совокупность зрелых плодов одного соцветия, четко обособленного от вегетативной части побега. Очень крупное соплодие маклюры образуется от срастания плодов с сочной осью и другими элементами соцветия.

• 2.    Роль элементов в функционировании организма человека общеизвестна. Они являются неотъемлемой частью биохимических процессов. Растения - основной источник элементов. Последние, находятся в растениях в естественном наборе в органически связанной, наиболее доступной и усвояемой форме, т.е. в оптимальном для человека соотношении. Содержание элементов в лекарственном растительном сырье (ЛРС) вполне достаточно для терапевтического влияния на организм [7,8].

• 3.    Для более подробной оценки фитохимического состава плодов маклюры оранжевой методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) нами проведено дополнительное исследование по изучению гексанового экстракта. Для получения гексанового экстракта 20 г измельченного сырья было экстрагировано гексаном в количестве 200 мл в аппарате Сокслета до полного истощения сырья.

• 4.    Для сравнения качественного состава экстрактов мы воспользовались методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), для чего использовали хроматографические пластины марки «Sorbfil» ПТСХ-АФ-В-УФ 10x15. Для изофлавонов и фитостеринов нами была подобрана система растворителей гексан-этилацетат (10:1), опрыскивание проводили 1% раствором ванилина в серной кислоте с дальнейшим нагреванием при 105° в течении 10 мин.

На поперечном срезе хорошо прослеживаются три "пояса" - первый и третий представлены непосредственно мякотью плода, средний включает в себе семена в количестве 40-50 штук и более. При повреждении плод выделяет липкий млечный сок кремового цвета.

Для определения числовых характеристик сырья нами были определены влажность, общая зола и зола нерастворимая в кислоте хлороводородной, а также экстрактивные вещества. табл. 1

Растения являются не только основными источниками элементов. Наряду с этим элементный состав отражает воздействие окружающей среды на растение. Определение уровня экологической чистоты важно для оценки качества и безопасного применения ЛРС, способного накапливать токсические элементы [8].

Определение микроэлементного состава плодов и экстрактов маклюры проводили при помощи атомно-эмиссионного спектрографа ДФС-8 с использованием ГО. Метод исследования описан в разделе 2. Результаты исследований приведены в табл. 2.

Идентификацию анализируемых веществ осуществляли в сравнении со стандартными образцами лупеола ("Santa Cruz Biotechnology", США), β-ситостерина и изофлавонов осайина и помиферина ("BioBioPhaCo., Ltd.", Китай).

Результаты.

Таблица. 1

• 1 .Результаты определения числовых характеристик плодов маклюры оранжевой

  Влажность x %	Общая зола, x %	Зола нерастворимая в HCl, x %	Экстрактивные вещества, x %
  			Вода	Этанол 40%	Этанол 70%	Этанол 90%	Гексан
  10,82±0,22	3,61±0,09	0,47±0,03	27,1±0,51	25,9±0,44	28,5±0,53	31,2±0,36	33,4±0,48

Для определения числовых характеристик сырья нами были определены влажность, общая зола и зола нерастворимая в кислоте хлороводородной, а также экстрактивные вещества.

Спектральный элементный анализ плодов маклюры оранжевой

Таблица. 2

№	Элемент	Плоды, мг/г	Спиртовой экстракт, мг/г	Гексановый экстракт, мг/г	Масляный экстракт, мг/г
1	K	20,235±0,441	16, 594±0,353	13,614±0,321	10,318±0,223
2	Ca	5,459±0,123	3,398±0,082	3,216±0,072	4,137±0,115
3	Mg	2,326±0,051	2,513±0,054	1,526±0,036	1,349±0,033
4	Si	1,232±0,027	0,934±0,021	1,013±0,028	0,754±0,015
5	P	1,214±0,028	0,824±0,022	1,331±0,039	2,095±0,048
6	Na	0,317±0,007	0,264±0,007	0,134±0,003	0,134±0,003
7	Al	0,065±0,002	0,005±1∙10-4	0,005±1∙10-4	0,004±9,5∙10-5
8	Fe	0,063±0,002	0,031±0,001	0,008±1,5∙10-4	0,055±0,001
9	Sr	0,061±0,001	0,003±1∙10-4	0,013±2,910-4	0,051±0,001
10	Cu	0,005±1∙10-4	0,003±1∙10-4	0,011±2,8∙10-4	0,004±9,8∙10-5
11	Mn	0,004±9∙10-5	0,003±1∙10-4	0,001±3∙10-5	0,004±1,1∙10-4
12	Pb	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001
13	Ni	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001
14	Mo	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001
15	Cr	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001
16	Sn	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001
17	Bi	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001
18	V	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001

В плодах маклюры было обнаружено 18 элементов. Из них в наибольшем количестве содержаться такие макроэлементы как K, Ca, Mg, Si, P, Na. При этом отмечено, что практически все элементы частично или полностью могут переходить в экстракционные извлечения (таблица 3.5).

Для оценки экологической чистоты ЛРС особое значение имеют результаты определения в нем особо токсичных металлов, таких как кадмий, руть, свинец, мышьяк. Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о невысоком содержании или отсутствии этих веществ, как в плодах растения, так и в их экстрактах.

Условия хроматографического анализа описаны в разделе 3.

Результаты, представленные на хроматограмме (рис.1), позволяют утверждать о преимущественном содержании в плодах маклюры произрастающей в Казахстане таких биологически активных веществ как: тритерпены, изофлавоны, фитостерины, токоферолы и полиненасыщенные жирные кислоты. Относительное количественное содержание БАВ представлено в табл.3.

Согласно результатам, в наибольшем относительном количестве в экстракте преобладают тетрациклический тритерпен – ланостерол (34,16%) и его ацетат (15,83%), а также пентациклический тритерпен лупеол (25,84%) и его ацетат (8,39%).

Ланостерол является предшественником стероидных соединений и известен своими антиоксидантными, антимутагенными и антиканцерогенными свойствами. Изучены свойства ланостерола содержащегося в чаге, который входит в препараты «Настойка чаги» и «Бефунгин» [9, 10].

Широко описаны свойства лупеола выделенного из коры березы, по своей структуре он очень близок к бетулину. Установлено что данные соединения обладают антиоксидантной, противовоспалительной и иммуномодулирующей активностями. Имеются также положительные данные о влиянии лупеола на заболевания предстательной железы. Была доказана эффективность лупеола в торможении пролиферации раковых клеток [9].

1 - пальмитиновая кислота, 2 - линолевая кислота, 3 - додекатриеновая кислота, 4 - олеиновая кислота, 5 - сквален, 6 - α-токоферола ацетат, 7 - кампестерин, 8 -стигмастерин, 9 - обтусифолиол, 10 - ситостерин, 11 - фукостерин, 12 - ланостерол, 13 -лупеол, 14 - ланостерола ацетат, 15 -лупеола ацетат, 16 - изофлавоны.

I - лупеол, II - ситостерин, III - осайин, IV - помиферин.

Рис.1. ГХ-МС хроматограмма гексанового экстракта плодов маклюры оранжевой.

Таблица.3

Относительное содержание БАВ идентифицированных в гексановом экстракте плодов маклюры методом ГХ-МС

№	Химическое соединение	Время удерживания	мин Площадь пика, %
1	Ланостерол	58,398	34,16
2	Лупеол	59,933	25,84
3	Ланостерола ацетат	62,345	15,83
4	Лупеола ацетат	64,346	8,39
5	Изофлавоны	73,995	2,17
6	Ситостерин	56,799	1,43
7	Линолевая кислота	31,874	0,37
8	Сквален	45,117	0,37
9	Обтусифолиол	55,991	0,29
10	Фукостерол	57,457	0,29
11	Стигмастерол	54,857	0,24
12	Кампестерол	53,857	0,23
13	Пальмитиновая кислота	25,515	0,22
14	α-токоферола ацетат	51,225	0,2
15	Додекатриеновая кислота	34,099	0,08
16	Олеиновая кислота	41,149	0,05

Плоды маклюры богаты содержанием группы фитостеринов, из которых наибольший интерес представляет ситостерин. Данное соединение по своей химической структуре очень близко к холестерину. Наиболее широкое применение находит β-ситостерин, выделенный из различных растительных источников и использующийся для лечения гиперплазии предстательной железы и простатита. β-ситостерин обладает высокой тропностью к тканям предстательной железы, где он ингибирует синтез простагландинов и оказывает стабилизирующее влияние на гиперплазированные ткани [11,12].

При анализе хроматографических пиков системой «NIST MS SEARCH» были обнаружены две изофлавоноидные структуры, при этом библиотекой было предложено наиболее близкое к ним вещество – изофлавон сканденон, который является изомером осайина, содержащегося в плодах маклюры.

На данном этапе нами было предположено, что этими изофлавонами являются осайин и помиферин, поскольку поиск данных веществ в библиотеках ―Nist05 SpectraLib‖ и ―Wiley 7th/Nist 05 MS lib‖ показал отсутствие спектров этих соединений.

Таким образом, на основании предварительных фитохимических исследований гексанового экстракта методом ГХ-МС нами было установлено, что плоды маклюры богаты БАВ, из которых наибольший интерес представляют комплексы тритерпенов и фитостеринов, а также изофлавоноидные соединения. Поэтому следующим этапом нашей работы было сравнительное изучение извлечений из плодов маклюры полученных при помощи различных экстрагентов. Так нами были исследованы следующие экстракты: водно-этанольный 40%, этанольный 96%, хлороформный, гексановый, масляный. Экстракты были получены нагреванием в колбе снабженной обратным холодильником на водяной бане в течение 2 часов в соотношении «сырье : экстрагент» 1:10. Масляный экстракт был получен путем мацерации подсолнечным маслом в соотношении «сырье:экстрагент» 1:10 с нагреванием при постоянной температуре 50°С в течение 24 часов. Подсолнечное масло было выбрано в качестве экстрагента ввиду его широкого использования для получения масляных экстрактов.

ТСХ-хроматограмма анализа экстрактов маклюры.

о

о

О

12 346а УВУ

• 1    - водно-этанольный экстракт; 2 – этанольный экстракт; 3 – хлороформный экстракт; 4 - гексановый экстракт; 5 – масляный экстракт; 6 - лупеол; 7 – β ситостерин; 8 - осайин; 9 - помиферин.

Рис.2. ТСХ-хроматограмма анализа экстрактов маклюры. Данные вещества были выбраны в качестве стандартов в связи с их преимущественным содержанием в маклюре оранжевой [12].

Пробы наносили на пластины хроматографическим шприцом в количестве 3 мкл, для чего экстракты предварительно разводили в 10 раз (масляный экстракт разводили в гексане). В результате анализа методом ТСХ, было обнаружено более 8 соединений, среди них идентифицированы изофлавоны помиферин и осайин, а также β-ситостерин, лупеол и вещества схожей структуры (рис.2).

Подобранные нами условия позволяют разделить компоненты экстрактов, которые проявляются под воздействием ванилинового реактива в виде окрашенных зон от светло-розового до фиолетового цвета для веществ стероидной структуры и лимонно-желтого цвета для изофлавонов.

Визуальная оценка площадей пятен позволяет заключить, что в плодах маклюры доминируют липофильные вещества, из которых в наибольшем количестве представлены фитостерины и изофлавоны. При этом на основании полученных результатов оценки БАВ в различных извлечениях весьма перспективным является разработка масляного экстракта плодов маклюры. Растительные масла не токсичны, содержат широкий спектр таких активных соединений, как токоферолы, непредельные жирные кислоты и позволяют получать суммарные фитопрепараты с высоким содержанием липофильных действующих веществ, пригодные для введения в лекарственные формы без предварительного упаривания и сушки.

Вывод и обсуждение.

Согласно литературным данным маклюра оранжевая является источником ценных биологически активных липофильных веществ, таких как изофлавоны, тритерпены и фитостерины, обладающие простатопротекторными свойствами.

Теоретические и экспериментально обоснован подход к разработке масляного экстракта из плодов маклюры оранжевой. На основаниии фармако-технологических и физико-химических исследований подсолнечное масло по выходу БАВ было выбрано в качестве эффективного экстрагента.

Наиболее рациональным признан метод РПА-экстракции, который позволил извлечь на 30 % больше БАВ в сравнении с другими методами. Изучены и обоснованы наиболее эффективные условия экстракции данным методом. Разработана технологическая схема производства экстракта, описаны основные технологические стадии.