Физиологические особенности пространственного обучения и сложного пищевого поведения у крысят после гипоксического воздействия

Развитие центральной нервной системы в раннем онтогенезе представляет собой строго скоординированный комплекс физиологических процессов, определяющих формирование интегративной деятельности мозга и механизмов высшей нервной деятельности (ВНД). Важнейшим условием для адекватного нейрогенеза, синаптогенеза и миелинизации проводящих путей является стабильное обеспечение развивающихся нервных тканей кислородом. В условиях физиологической нормы созревающий мозг обладает специфическими механизмами адаптации и пластичности, направленными на поддержание гомеостаза. Однако действие гипоксического фактора в критические периоды преи постнатального развития способно временно или необратимо изменять траекторию созревания нейрональных сетей, что в дальнейшем отражается на качестве формирования когнитивных функций как у человека, так и у лабораторных животных [1–3].

В рамках физиологии высшей нервной деятельности человека нормальное развитие пространственной ориентации, внимания и памяти базируется на системной интеграции корково-подкорковых структур. Перинатальный дефицит кислорода мо- дифицирует естественный ход созревания синаптической архитектоники в ключевых структурах мозга, ответственных за когнитивные процессы, в частности в гиппокампе и префронтальной коре. С позиций системной физиологии, даже транзиторное ограничение оксигенации нарушает баланс между процессами возбуждения и торможения, сдвигает физиологические сроки формирования долговременной синаптической потенциации и ограничивает пластический потенциал нейронов. В отдаленном периоде данные изменения модифицируют системный ответ организма, выражаясь в замедлении формирования пространственных навыков, нарушении механизмов долговременной памяти и неустойчивости внимания [4–6].

Экспериментальное моделирование на лабораторных животных, в частности на крысах, позволяет детально изучить нормальные физиологические константы развития центральной нервной системы (ЦНС) в онтогенезе и их модификацию под влиянием средовых факторов. В норме у крысят раннего возраста активно формируются пространственные когнитивные карты и пищедобывательное поведение, что требует высокого уровня метаболической активности гиппокампальных нейронов. Перене- сенная гипоксия нарушает нормальный объемный рост и цитоархитектонику гиппокампа, лимитирует синаптическую пластичность и изменяет естественный паттерн ориентировочно-исследовательской активности. В результате животные демонстрируют отклонения от типичных физиологических показателей при выполнении когнитивных тестов, обнаруживая дефицит пространственной памяти на фоне компенсаторного изменения уровня эмоциональной реактивности и тревожности [7, 8].

С точки зрения молекулярной и клеточной физиологии, в основе поддержания когнитивных функций и способности к обучению лежит непрерывный нейрогенез и адекватное нейрохимическое обеспечение синаптической передачи. Физиологический ответ ткани мозга на гипоксическое воздействие включает в себя каскад реакций: от срочной метаболической адаптации до долговременных перестроек экспрессии генов. Нарушение этих процессов приводит к изменению динамики нейротрофических факторов (в частности, BDNF) и дисбалансу моноаминергических систем, включая серотонинергическую. Подобные сдвиги ограничивают физиологический резерв выживаемости новорожденных нейронов, подавляют их интеграцию в существующие нейрональные ансамбли и изменяют нормальный ход созревания функциональных систем мозга [8, 9].

Таким образом, исследование физиологических закономерностей пространственного обучения и формирования сложных поведенческих актов в условиях изменения кислородного гомеостаза имеет фундаментальное значение. Понимание естественных границ адаптационного потенциала ЦНС в раннем онтогенезе и механизмов сохранения синаптической пластичности необходимо для раскрытия общих принципов функционирования систем ВНД, а также для научного обоснования методов физиологической коррекции и поддержания резервных возможностей мозга на ранних этапах индивидуального развития.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучить особенности формирования пространственного обучения и сложных паттернов пищедобывательного поведения у крысят в раннем онтогенезе, подвергшихся острой нормобарической гипоксии, для раскрытия долгосрочных физиологических механизмов адаптации и пластичности высшей нервной деятельности.

Для реализации поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

• •    оценить исходный уровень ориентировочноисследовательской активности и динамику формирования пространственной памяти у подопытных животных в тесте «Пространственное обучение в лабиринте Барнс»;

• •    определить особенности выработки, консолидации и воспроизведения навыков сложного пище-добывательного поведения у крысят в условиях «Сложного пищевого лабиринта»;

• •    выявить характер и степень выраженности отставленных изменений в когнитивных процессах и поведении у животных, перенесших острую нормобарическую гипоксию, в сравнении с контрольной группой;

• •    проанализировать взаимосвязь между перенесенным гипоксическим воздействием в раннем возрасте и скоростью пространственной ориентации на разных этапах тестирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на крысах линии Wistar. Исходное родительское стадо формировали из половозрелых особей обоего пола (30 самок, 10 самцов), разделенных на две эквивалентные группы с применением метода рандомизации. Животных содержали в стандартных условиях вивария при инвертированном световом режиме (12 ч – свет / 12 ч – темнота) на сбалансированной диете со свободным доступом к воде.

Полученное потомство первого поколения находилось на совместном вскармливании с матерями в индивидуальных клетках до 30-го дня постнатального развития, после чего производилась сепарация крысят. Общий объем исследованной выборки потомства составил: в контрольной группе (1) – 179 особей (93 самца и 86 самок), в опытной (2) – 185 особей (103 самца и 82 самки).

Для изучения онтогенетических особенностей ВНД использовали модель острой нормобарической гипоксии (ОНГ), воспроизводящую условия недоношенной беременности у человека [10, 11]. Физиологическое моделирование измененного газового гомеостаза осуществляли на вторые сутки постнатального созревания (Р2), принимая день рождения потомства за точку отсчета (Р0). Перед началом процедуры проводили антропометрический контроль (взвешивание) крысят, после чего каждый помет разделяли на две равные части с учетом половой принадлежности:

Группа 1 (контроль, (n=164); 82 самца, 82 самки) – интактные животные. Для нивелирования фактора хендлинга и стресса от манипуляций крысят помещали в мультигазовый инкубатор на 2 часа при температуре 37ºС в условиях нормоксической атмосферной среды.

Группа 2 (эксперимент, (n=164); 82 самца, 82 самки) – особи, подвергавшиеся сеансу ОНГ на этапе Р2. Кислородную депривацию моделировали путем двухчасовой экспозиции животных в герметичной камере с контролируемой газовоздушной смесью

(8% O 2 , 92% N2) при стабильном температурном режиме 37 ºС.

Параметры газовой среды и экспозиции воссоздавали с помощью мультигазового инкубатора New Brunswick Scientific «Innova CO-48 CO2» (США). Выбор характеристик гипоксического воздействия был обоснован результатами предварительного тестирования и верифицирован по данным литературы. Остальные животные из общей выборки (11 самцов и 4 самки контроля; 21 самец опытной группы) составили технологический резерв и использовались для контроля физиологической сохранности пометов.

Для комплексного анализа пространственной памяти, когнитивного статуса и динамики обучения у животных, перенесших ОНГ на этапе Р2, на 42–47-е сутки постнатального развития (период полового созревания) выполняли комплекс поведенческих тестов. Оценку пространственного обучения и сохранности когнитивных карт проводили с использованием лабиринта Барнс. Динамику формирования, консолидации и воспроизведения системных поведенческих навыков изучали в тесте на выработку условного пространственного пищедобывательного рефлекса («Сложный пищевой лабиринт»).

Исследование одобрено Биоэтическим комитетом при Самарском государственном медицинском университете № 245 от 10 сентября 2024 г.

Математическую и статистическую обработку полученных результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ STATISTICA 10.0 (StatSoft, США). Проверку характера распределения количественных признаков в выборках на соответствие закону нормального распределения выполняли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Ввиду подтвержденного нормального распределения данных, межгрупповые сравнения проводили методами одномерного и многомерного дисперсионного анализа (ANOVA/MANOVA).

При обнаружении статистически значимого влияния исследуемых факторов или их интерференции применяли апостериорный post-hoc анализ с использованием критерия наименьшей значимой разности Фишера (Fisher LSD test). Различия признавались статистически значимыми при уровне ошибки первого рода p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты тестирования интегративной деятельности мозга крысят в лабиринте Барнс приведены на рисунке 1.

В ходе эксперимента у животных обоего пола в обеих группах зафиксирована положительная динамика результативности при прохождении сложного пищевого лабиринта. В частности, у самцов группы 1 число успешных реакций возрастало относительно исходного уровня: на 2-й день – на 22,7% (p=0,031), на 3-й – на 27,3% (p<0,001), а на 4-й – на 34,1% (p<0,001). Схожий прирост показателей наблюдался и у самок этой же группы: на 2-е сутки обучения – на 22,5% (p=0,022), на 3-и – на 27,5% (p=0,042), на 4-и – на 35,0% (p=0,011).

Межполовой анализ выявил значимые различия внутри группы 1 в начале тренировок. Так, в 1-й день результативность самок уступала показателям самцов на 9,1% (p=0,027), а на 2-й день – на 9,3% (p<0,001).

У самцов группы 2 также отмечалось нарастание числа успешных действий: на 2-е сутки прирост составил 7,3%, к 3-му дню он достиг 19,5% (p=0,022), а к 4-му – 26,8% (p=0,034) относительно исходного уровня. У самок этой же группы выраженное увеличение показателя регистрировалось на протяжении всего периода обучения: на 2-й день – на 12,1% (p=0,003), на 3-й – на 24,2% (p=0,017), на 4-й – на 27,3% (p=0,004). В отличие от группы 1, межполовые различия в группе 2 оставались статистически значимыми на всех этапах эксперимента. Продуктивность самок стабильно уступала показателям самцов: в 1-й день – на 19,5% (p=0,026), во 2-й – на 15,9% (p=0,003), в 3-й – на 16,3% (p=0,027) и в 4-й – на 19,2% (p=0,002).

Межгрупповой анализ показал, что животные группы 2 демонстрировали более низкую результативность в сложном пищевом лабиринте по сравнению с особями аналогичного пола из группы 1. Так, у самцов группы 2 число успешных попыток уступало показателям самцов группы 1 на 6,8% в 1-й день, на 18,5% (p < 0,001) – во 2-й, на 12,5% (p=0,014) – в 3-й и на 11,9% (p=0,022) – в 4-й день тренировок. У самок группы 2 отставание от представительниц группы 1 носило еще более выраженный характер и регистрировалось на протяжении всего эксперимента: в 1-е сутки – на 17,5% (p=0,002), во 2-е – на 24,5% (p=0,017), в 3-и – на 19,6% (p=0,004) и в 4-е – на 22,2% (p=0,038).

Рисунок 1. Динамика числа успешных попыток у крыс в процессе обучения в сложном лабиринте с пищевым подкреплением Figure 1. Dynamics of the number of successful attempts in rats during training in a complex maze with food reinforcement

Оценка поведенческих показателей животных в сложном пищевом лабиринте осуществлялась методом дисперсионного анализа для повторных измерений (ANOVA). В качестве межгрупповых фиксированных факторов оценивали экспериментальное воздействие (фактор «ОНГ / контроль») и половую принадлежность (фактор «пол»). В роли внутригруппового повторного фактора выступала продолжительность обучения (фактор «день тренировок», с 1-го по 4-й дни).

Проведенный многофакторный анализ выявил следующие закономерности:

Во всех исследуемых группах как у самцов, так и у самок подтверждено высокозначимое изолированное влияние фактора «день тренировок» на ключевые критерии выработки навыка, что отразилось в закономерном увеличении числа выполненных реакций (F(1;324)=10,7; p=0,001) и сопутствующем снижении количества допущенных ошибок (F(1;324)=16,3; p=0,001). Указанный факт строго свидетельствует об успешном формировании когнитивной карты лабиринта и консолидации памятного следа у подопытных животных в ходе сессий.

Был зарегистрирован выраженный самостоятельный эффект фактора «пол». Данный параметр статистически достоверно предопределял как общую продуктивность – количество выполненных реакций (F(1;324)=6,27; p=0,019), так и точность выполнения задачи – число совершенных ошибок (F(1;324)=12,79; p=0,001). Это указывает на исходные межполовые различия в стратегиях пространственного обучения или уровне мотивации грызунов.

В подгруппе самцов группы 2 дисперсионный анализ зафиксировал значимое влияние изолированного фактора «ОНГ» (F(1;324)=5,49; p=0,001). Кроме того, обнаружилось достоверное межфакторное взаимодействие «ОНГ/«день обучения» (F(1;324)=9,72; p=0,001). Данное сопряжение верифицировано как для регистрируемых реакций, так и для ошибочных побежек. Это доказывает, что ОНГ смещает нормальную траекторию (скорость и характер) обучения самцов во времени.

Специфический паттерн изменений обнаружен у самок группы 2. Здесь изолированный фактор «ОНГ» (F(1;324)=5,33; p < 0,001), а также его интерференция с продолжительностью тренировок («ОНГ/«день обучения»: (F(1;324)=2,94; p<0,001) оказали высокозначимое селективное воздействие на количество совершенных ошибок. Наконец, сочетанное влияние факторов «ОНГ/«пол» (F(1;324)}=14,53; (p=0,025) окончательно валидирует гипотезу о том, что ОНГ модифицирует когнитивные функции у животных разного пола неодинаково, оказывая диморфное действие на поведенческую пластичность.

ОБСУЖДЕНИЕ

При комплексном анализе динамики пространственного обучения грызунов в тесте «Лабиринт Барнс» на 42–47-е сутки постнатального развития были установлены некоторые закономерности. У крыс обоего пола во всех экспериментальных группах по мере продолжения тренировок отмечалось сокращение латентного времени обнаружения истинной норки, что свидетельствует об общей сохранности базовой способности к формированию навыка пространственной ориентации. Однако у животных, перенесших ОНГ, данный показатель на протяжении всего цикла обучения и итогового тестирования оставался существенно более высоким, чем у интактного контроля. При этом внутри группы 2 был зарегистрирован отчетливый половой диморфизм: у самок, подвергшихся гипоксическому воздействию, латентный период захода в целевое убежище был выражен сильнее, чем у самцов.

Количество ложных обследований (ошибок), совершаемых грызунами в процессе тренировочных сессий, прогрессивно снижалось от первого к финальному дню эксперимента во всех исследуемых когортах. Тем не менее у крыс, перенесших ОНГ, частота совершения ошибок оставалась значимо выше на протяжении всех этапов тестирования по сравнению с интактными сверстниками.

Анализ гендерного фактора внутри группы ОНГ показал, что самки демонстрировали наименьшую точность выполнения когнитивной задачи, совершая достоверно большее число неверных реакций, нежели самцы из той же группы.

Для углубленной оценки когнитивных паттернов и способности грызунов к формированию устойчивой пространственной памяти был проведен детальный анализ изменения их поискового поведения. В соответствии со стандартными протоколами выделяли три базовых типа стратегий:

• •    Случайная (хаотичное перемещение по установке, сопряженное с многократным пересечением геометрического центра платформы).

• •    Последовательная/сериальная (систематический обход норок по периметру края платформы).

• •    Пространственная (направленное движение к убежищу с использованием внелабиринтных визуальных ориентиров).

В процессе обучения у животных обеих экспериментальных групп фиксировался общий вектор трансформации поведения: постепенное сокращение доли примитивной случайной стратегии и закономерное увеличение удельного веса более эффективных последовательной и пространственной стратегий. Однако характер этой трансформации принципиально различался между группами: у интактных животных перестройка поведенческих паттернов носила строго линейный, поступательный характер, прямо коррелирующий с днем обучения, что указывает на физиологически адекватное формирование когнитивной карты пространства. Напротив, у крыс, перенесших ОНГ, динамика смены стратегий имела выраженный хаотичный, дискретный характер. Данная флуктуация паттернов свидетельствует о глубоком нарушении процессов консолидации пространственной памяти и неспособности эффективно удерживать мнестический след. Описанный дефицит пространственного картирования в существенно большей степени затрагивал самок, перенесших гипоксию, нежели самцов, что подчеркивает уязвимость женского пола к отсроченным когнитивным последствиям повреждающего воздействия.

При анализе когнитивных способностей грызунов в тесте «Сложный пищевой лабиринт» на 42–47-е сутки постнатального развития было установлено, что количество ошибок, совершаемых животными обоего пола в обеих группах, прогрессивно снижалось по мере продолжения тренировочных сессий. Это указывает на принципиальную сохранность базовых механизмов обучения у всех подопытных особей. Тем не менее у крыс, перенесших ОНГ, на протяжении всего цикла обучения и итогового тестирования регистрировалось значимо большее число ошибочных действий по сравнению с интактным контролем. Оценка полового диморфизма внутри этой когорты показала, что самки демонстрировали наименьшую точность прохождения лабиринта, совершая достоверно больше ошибок, чем самцы.

Число успешно выполненных реакций в СПЛ у крыс обоего пола во всех группах неуклонно возрастало от первого к финальному дню эксперимента, но у животных, подвергшихся ОНГ, продуктивность на протяжении всех дней тренировок оставалась существенно более низкой, чем у интактных сверстников. При этом внутри группы 2 также прослеживались выраженные межполовые различия: самки по количеству целевых реакций уступали самцам аналогичной группы.

Результаты тестирования в сложном пищевом лабиринте свидетельствуют о том, что ОНГ угнетает способность грызунов к формированию пространственного пищедобывательного навыка, причём данный дефицит зависим от пола и наиболее выражен у самок, у которых зафиксировано значимое снижение числа целевых реакций относительно контроля.

Полученные нами данные согласуются с результатами ряда независимых исследований, посвященных изучению отсроченных когнитивных эффектов неонатальной гипоксии. В частности, Arteni и соавторы на модели гипоксически-ишемического повреждения головного мозга крыс (на 7-е сутки пост- натального развития) также выявили избирательное нарушение пространственного обучения и рабочей памяти в водном лабиринте Морриса у 12недельных самок [12]. Развитие когнитивного дефицита вследствие подобных патологических состояний подтверждается и в работе Morales с коллегами [13]: авторы продемонстрировали угнетение непространственной рабочей памяти в тесте «Распознавание новых объектов» после перенесенной грызунами глобальной асфиксии, однако половые различия в данном исследовании не анализировались. В свою очередь, Buwalda и соавт. установили, что трехкратная неонатальная аноксия приводит к стойкому нарушению выработки навыков с положительным подкреплением в норковой камере у самцов [14], в то время как самки из анализа были исключены. Таким образом, уязвимость мнестических процессов к гипоксическому стрессу в раннем онтогенезе является универсальной закономерностью, однако глубина и характер повреждений могут определяться фактором пола.

В основе пространственного обучения лежит формирование когнитивной карты – топографического представления об окружающем пространстве, базирующегося на анализе геометрических контуров среды и пространственном распределении ключевых стимулов. Адекватная навигационная способность грызунов позволяет им интегрировать связи между этими стимулами и определять наиболее короткую, энергетически выгодную траекторию движения к цели. Соответственно, дефицит пространственного картирования или невозможность использования сформированной ментальной карты для построения навигационной стратегии проявляется в неспособности животных находить кратчайший путь к целевой норке в лабиринте Барнс. Подобные когнитивные сбои традиционно рассматриваются как маркер синаптической дисфункции и нарушения пластичности в нейронных сетях гиппокампа [15].

При анализе отсроченных последствий неонатальной гипоксии как у человека, так и у лабораторных животных, во многих работах постулируется более высокая уязвимость мужского пола. Тем не менее накопленные в литературе данные остаются неоднозначными, а в значительном числе нейро-биологических исследований половой диморфизм до сих пор игнорируется [16, 17, 18]. В то же время прицельное изучение влияния гипоксических и ги-поксически-ишемических поражений мозга на когнитивную сферу грызунов заставило ряд авторов констатировать более глубокие поведенческие расстройства именно у самок [12, 19]. Результаты нашей работы согласуются с этой тенденцией: несмотря на то, что у самцов после перенесенной ОНГ также регистрировались значимые сдвиги в процессах обу- чения и памяти, наиболее выраженная деградация пространственного пищедобывательного навыка в сложном пищевом лабиринте была зафиксирована в группе самок.

Клиническая практика наглядно демонстрирует наличие полового диморфизма в эпидемиологии, характере манифестации и долгосрочных последствиях патологий у детей, перенесших перинатальную гипоксию. В экспериментальных исследованиях этот феномен подтверждается исходными различиями в базальной поведенческой активности между самцами и самками. Межполовые особенности отчетливо прослеживаются в когнитивной сфере; в частности, в норме самки нередко уступают самцам по эффективности пространственной памяти. Кроме того, характер полоспецифических сдвигов в двигательной активности и стресс-реактивности гипота-ламо-гипофизарно-адреналовой системы напрямую детерминирован природой и модальностью стрес-сорного фактора. Сравнительный анализ интактных и овариоэктомированных особей позволил доказать, что пиковые концентрации эстрогенов (в фазу эструса) модулируют поведенческие паттерны, экспрессию нейрохимических маркеров, интенсивность дендритного спраутинга и чувствительность к фармакологическим агентам. Таким образом, исходный уровень базальной активности животных и специфика используемых экспериментальных тестов способны существенно смещать интерпретацию поведенческих и фармакологических феноменов.

В совокупности наши собственные результаты и накопленные литературные данные указывают на то, что последствия неонатальной гипоксии характеризуются гетерогенностью, а также разной направленностью и выраженностью поведенческих девиаций у животных разного пола. Это верифицирует гипотезу о том, что фактор пола оказывает определяющее влияние на характер и степень проявления когнитивного и неврологического дефицита.

ВЫВОД

Острая нормобарическая гипоксия приводит к стойкому угнетению когнитивных функций у подопытных животных в отдаленном периоде онтогенеза (42–47-е сутки жизни), что выражается в достоверном снижении эффективности пространственного обучения и долговременной памяти. В тесте «Лабиринт Барнс» у животных, перенесших ОНГ, верифицирован дефицит пространственного картирования среды. Нарушение процессов консолидации мнестического следа проявляется в значимом увеличении латентного периода поиска целевого убежища, росте числа совершаемых ошибок, а также в хаотичном, нелинейном характере смены поисковых стратегий по дням тренировок. В тесте «Сложный пищевой лабиринт» у крыс после перенесенной ОНГ установлено нарушение выработки пространственного пищедобывательного навыка. Отсроченные когнитивные последствия ОНГ характеризуются выраженным половым диморфизмом и носят полозависимый характер. Несмотря на наличие поведенческих и мнестических сдвигов у самцов, перенесших воздействие, наиболее глубокое и стойкое угнетение обучаемости, критическое снижение продуктивности и рост ошибочных побежек на протяжении всех дней эксперимента зарегистрированы у самок на фоне меньшего числа успешных попыток. Выявленная высокая уязвимость когнитивной сферы самок к гипоксическому прессингу согласуется с фундаментальными представлениями о половом диморфизме базальной активности, пластичности дендритного аппарата гиппокампа и гормон-зависимой реактивности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, что подчеркивает необходимость обязательного учета фактора пола при моделировании перинатальной патологии головного мозга.