Физиологические особенности устойчивых к ванкомицину штаммов коагулазонегативных стафилококков

Появление в 80-х гг. прошлого столетия резистентности бактерий родов Enterococcus и Staphylococcus к гликопептидным антибиотикам ванкомицину и тейкопланину быстро нашло биохимическое и генетическое объяснение благодаря интенсивному изучению ванкомицин-резистентных штаммов энтерококков (Al-Obeid et al., 1990) и S. aureus (Lyon et al., 1987). Однако, несмотря на неуклонный рост резистентных штаммов, гликопептидные антибиотики во всех странах мира в настоящее время остаются препаратами выбора при инфекциях, обусловленных метициллин-резистентными штаммами S. aureus (MRSA) и S. epidermidis (MRSE), а также устойчивыми к ампициллину и аминогликозидам штаммами энтерококков (Huycke et al., 1998; Зайцев, 2003).

Существенным событием последнего времени является появление и значительное увеличение гетерорезистентности к гликопептидам среди мети-циллин-устойчивых коагулазонегативных стафи-локков (КНС), механизмы которой до сих пор не раскрыты (Sieradzki et al., 1999). Это определяет необходимость дополнительных исследований природы такой устойчивости КНС и поиска путей ее преодоления.

Типы устойчивости к гликопептидам, обнаруженные среди различных видов энтерококков, обусловлены генами резистентности, которые расположены на мобильных генетических элементах и способны к переносу не только в чувствительные реципиенты этого рода, но и в другие грамположи-тельные бактерии (Arthur et al., 1993). При этом ус- тановлено, что для штаммов S. aureus со сниженной чувствительностью или устойчивостью к ванкомицину (Van) характерно существенное утолщение клеточной стенки и избыточная продукция новых мишеней действия гликопептидов, локализованных вдали от истинных мишеней на плазматической мембране (Hanaki et al., 1998; Cui et al., 2003).

Механизмы устойчивости КНС к гликопептидам полностью не раскрыты (Biavasco et al., 2000). Показано, что устойчивые к Van КНС отличаются по некоторым свойствам (появлению множественной устойчивости к антибактериальным препаратам, изменению способности поглощать ванкомицин из среды культивирования) от чувствительных бактерий. Более того, гетерогенная природа устойчивости КНС к Van является характерной особенностью этой группы микроорганизмов (Biavasco et al., 2000).

Целью работы было изучение физиологических характеристик устойчивых к ванкомицину штаммов КНС и сравнение их со свойствами чувствительного к Van штамма S. epidermidis 33.

Материалы и методы

В работе исследовали коллекционный штамм S. epidermidis 33, полученный в ГНИИСКМБП им. Тарасевича, и его Van^r-производные, селекционированные в лаборатории культивированием на средах с возрастающими концентрациями антибиотика, а также клинические Van^r-штаммы КНС, выявленные посевом на агаризованные среды с градиентом концентрации этого антибиотика (Hanaki et al., 2001).

Выращивание бактерий проводили в питатель-

ной среде LB (Миллер, 1976) на орбитальном шейкере Certomat (Sartorius, Германия) при 150 об/мин и температуре 37ºC. За динамикой роста следили по изменению оптической плотности бактериальных культур при 600 нм на спектрофотометре PD-303 (APEL, Япония). МПК ванкомицина всех изучаемых штаммов определяли методом двукратных серийных разведений в 96-луночных иммунологических планшетах. В лунки, содержащие питательную среду LB, вносили бактерии логарифмической фазы роста в конечной концентрации 105 КОЕ/мл.

Определение чувствительности бактерий к низкомолекулярному пептиду варнерину проводили, как представлено ранее (Korobov et al., 2003). Чувствительность к антибиотикам выявляли методом диффузии с дисков (Скала и др. 2004). Степень гидрофобности поверхности бактериальных клеток определяли с помощью BATH-теста в двухфазной системе с гексадеканом (Rosenberg et al., 1980). Способность штаммов к образованию биопленок изучали в плоскодонных полистироловых планшетах при культивировании на среде LB при 37ºC без перемешивания в течение двух суток.

После окончания культивирования и двухкратного промывания биопленок физиологическим раствором проводили их окрашивание 0.1% раствором генцианвиолета. Количество связавшегося красителя определяли после экстракции пленок этанолом и измерения оптической плотности спиртовых экстрактов на планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США) при 570 нм (Christensen et al., 1985).

Результаты и их обсуждение

Результаты исследований представлены в табл. 1, 2. Обнаружено, что полученные в лаборатории под прессом возрастающих концентраций антибиотика Van^r-производные штамма S. epidermidis 33 и клинические Van^r-изоляты стафилококков обладали высоким уровнем устойчивости к Van (МПК от 250 до 1000 мкг/мл). Устойчивость всех изученных Van^r-штаммов к варнерину была приблизительно одинакова. МПК варнерина для них составляла ≥125 мкг/мл, что значительно превышало МПК варнерина родительского штамма S. epidermidis 33, равную 0.25 мкг/мл.

Таблица 1

Характеристика гидрофобности и чувствительности к ванкомицину и варнерину использованных в работе штаммов

Штаммы	МПК ванкомицина, мкг/мл	МПК варнерина, мкг/мл	Гидрофобность клеточной поверхности, %
S. epidermidis 33	1.1	0.25	34 – 55
S. epidermidis 33 Vanr (16)*	≥ 400.0	≥ 125.0	7 – 14
S. epidermidis 33 Vanr2 (12)*	≥ 500.0	≥ 125.0	7 – 26
S. epidermidis 33 Vanr3 (12)*	≥ 1000.0	≥ 125.0	22 – 26
КНС клинический 337 Vanr	≥ 250.0	≥ 62.5	5 – 15
КНС клинический 713 Vanr	≥ 250.0	≥ 62.5	4 – 9
КНС клинический 699 Vanr	≥ 250.0	≥ 62.5	6 – 12

(₁₂)_*, (₁₆)_* – число пассажей на средах с возрастающей концентрацией ванкомицина.

Таблица 2

Чувствительность исследованных штаммов стафилококков к антибиотикам

Штаммы

Антибиотики

Бен

Ген

Цеф

Тет

Лин

Окс

Риф

Эр

Фуз

Лев

Ван

Цип

S. epidermidis 33

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

Ч

S. epidermidis 33 Vanr (16)*

У

Ч

Ч

П

У

У

П

Ч

У

Ч

У

Ч

S. epidermidis 33 Vanr2 (12)*

У

Ч

Ч

П

У

У

П

Ч

У

Ч

У

Ч

S. epidermidis 33 Vanr3 (12)*

У

Ч

Ч

П

У

У

П

Ч

У

Ч

У

Ч

КНС клинический 337 Vanr

У

Ч

Ч

Ч

У

У

Ч

Ч

Ч

Ч

У

Ч

КНС клинический 713 Vanr

У

Ч

Ч

Ч

У

У

Ч

Ч

Ч

Ч

У

Ч

КНС клинический 699 Vanr

У

Ч

Ч

Ч

У

У

Ч

Ч

Ч

Ч

У

Ч

Степень устойчивости к антибиотикам: У – устойчивый, П – промежуточный, Ч – чувствительный. Антибиотики: Бен – бензилпенициллин, Ген – гентамицин, Цеф – цефалексин, Тет – тетрациклин, Лин – линкомицин, Окс – оксациллин, Риф – рифампицин, Эр – эритромицин, Фуз – фузидин, Лев – левомицетин, Ван – ванкомицин, Цип – ципрофлоксацин.

Как видно из табл. 1, для всех Van^r-штаммов было характерно значительное снижение гидрофобности клеточной поверхности. Возможно, это играет существенную роль в снижении чувствительности Van^r-штаммов к варнерину за счет ослабления гидрофобных взаимодействий молекул пептида с поверхностными структурами бактериальных клеток. Интересно отметить, что рост всех Van^r-штаммов подавлялся концентрациями NaCl (10 – 15%), при которых чувствительный штамм S. epidermidis 33 обладал способностью к обильному росту.

Исследования показали, что образование Vanr-фенотипа стафилококков сопровождалось приобретением устойчивости и к ряду других антибиотиков (табл. 2). При этом клинические штаммы, по данным первых экспериментов, обладали одинаковыми плазмидными спектрами.

Сравнительный анализ динамики роста на среде LB стафилококков, различающихся по чувствительности к Van, показал, что характерной особенностью всех клинических и лабораторных Vanr-штаммов стафилококков является значительное увеличение времени генерации и меньшее накопление биомассы по сравнению с исходными штаммами (рис. 1, 2). Особенно важно отметить, что приобретение устойчивости к Van не вызывало каких-либо значительных изменений в способности штаммов к образованию биопленок. На рис. 3 приведены результаты двух независимых исследований биопленок, образованных на вторые сутки культивирования штаммов.

штаммы

Рис. 3 . Способность изученных штаммов стафилококков к образованию биопленок:

1 – S. epidermidis 33, 2 – S. epidermidis 33Van^r (₁₆) , 3 – S. epidermidis 33 Van^r2 (₁₂) , 4 – S. epidermidis 33 Van^r3 (₁₂) , 5 – КНС клинический 337 Van^r, 6 – КНС клинический

713 Van^r, 7 – КНС клинический 699 Van^r

Таким образом, развитие устойчивости к Van сопровождается выраженными изменениями некоторых важных физиологических характеристик коагулазонегативных стафилококков. Обнаруженная взаимосвязь резистентности стафилококков к ванкомицину с изменением чувствительности к антибактериальному пептиду варнерину требует дальнейшего изучения для выяснения механизмов формирования защиты Van-устойчивых бактерий от катионных антибактериальных пептидов.

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края № 10-04-96086-р_урал_а, Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Междисциплинарного проекта фундаментальных исследований, выполняемых в учреждениях УрО РАН.