Физиолого-биохимические и оптические признаки листьев растений пшеницы при разных технологиях применения гербицидов

Несмотря на высокую избирательность действия, гербициды далеко не всегда оказываются нейтральными по отношению к растениям (1, 2). Оценка влияния химических гербицидов как на сорняки, так и на растения пшеницы позволяет разработать экологически рациональные подходы использования этих препаратов в более широких масштабах. Основные исследования в этой области направлены на изучение физико-химической природы проницаемости, абсорбции, передвижения и трансформации гербицидов в растениях, токсикологии и возможности снижения отрицательного воздействия на биосферу (1). Однако требуется дополнительный анализ соединений, снижающих или нейтрализующих токсическое действие гербицидов на культурные растения, а также результатов по совместному применению химических гербицидов и протектантов (антистрессовые биопрепараты и иммуностимуляторы).

В связи с этим целью нашей работы было определение физиологобиохимических показателей растений пшеницы при обработке посевов гербицидами в последействии, а также возможности снижения токсического действия последних при использовании в качестве неспецифических протектантов Гуми и Стифуна.

Методика. Объектом исследования служили растения яровой мягкой пшеницы сорта Башкирская 24. Полевые опыты проводили в ОПХ Башкирского НИИ сельского хозяйства «Казангуловское». Посевы пшеницы в фазе кущения обрабатывали гербицидами Трезор (1,2 л/га), Луварам (1,5 л/га) и баковыми смесями последних с антисрессовыми препаратами Стифун (9 г/га) и Гуми (75 г/га). Состояние хло-рофилл-белковых комплексов (ХБК) в хлоропластах оценивали по содержанию хлорофилла и оптическим характеристикам листьев. Хлоропласты выделяли по методике Вечер (3). Оптические свойства листьев — коэффициенты листовой абсорбции ( Аb , %), диффузного отражения ( Rd , %) и индикатриссы рассеивания света ( Rm , %) — определяли на лазерном спектрофотометре Лафот-97 (4).

Реакцию гемагглютинации проводили в микротитраторе Takachi, используя 2 % суспензию в физиологическом растворе обработанных трипсином и интактных эритроцитов (5, 6). Лектины экстрагировали 0,2 М NaCl в ацетатном буфере (рН 3,4), в состав которого входили ЭДТА, Тритон Х-100 и саркозилат натрия соответственно в концентрации 0,1 М, 1,0 и 0,2 %. Последние два ингредиента служили для выделения мембраносвязанных лектинов. Для дополнительной очистки гомогенат обрабатывали ацетоном. Выделенные грубые экстракты белков освобождали от детергентов диализом против фосфатного буфера (рН 5,3). Очищенные лектины выделяли из диализата методом аффинной хроматографии на овогеле по Луцику (5). Хроматографические фракции концентрировали ультрафильтрацией через стекловолокно. Содержание суммарных нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрически по Спирину (7), РНК — по орциновой реакции, ДНК — с дифениламиновым реактивом по Конареву с соавт. в модификации Джилеса с соавт. (8), белка — по Bradford, Lowry и с реактивом Несслера (9, 10). Преобразование алгоритмов и переработку первичной и вторичной информации осуществляли при помощи компьютера через блок сопряженного с ним экспериментального устройства.

Результаты. При обработке посевов пшеницы в фазе кущения—начала выхода в трубку гербицидами Трезор, Луварам, Бюктрил, Гранстар и Дезормон содер-94

жание хлорофилла b в листьях сорных растений, а также суммарное содержание хлорофилла а + b существенно снижались, что особенно проявлялось в течение первых 4 сут (табл. 1). Поглощение лазерного излучения ХБК в хлоропластах сорных растений значительно уменьшалось уже через несколько часов после обработки гербицидами; на 4-е сут коэффициент абсорбции достигал такового нежизнеспособных растений, то есть снижение содержания хлорофилла в листьях под влиянием гербицидов сопровождалось уменьшением абсорбирующей способности, что способствовало максимальному угнетению растений. Кроме того, гербициды, задерживаясь в клетках сорных растений и связываясь с ХБК, вызывали необратимые изменения обмена веществ, что приводило к гибели растений. По-видимому, это было обусловлено особенностями разложения этих гербицидов у двудольных растений (11).

• 1.    Оптические свойства и содержание хлорофилла в листьях сорных растений под влиянием обработки посевов пшеницы различными гербицидами

  Вид сорных растений	Срок отбора пробы	Коэффициент абсорбции, %	Содержание хлорофилла, мг/дм2
  			a 1	b 1	a + b
  		Б ю к т р и л
  Щирица запрокинутая	До обработки	82,84	3,32 ± 0,22	0,96 ± 0,13	4,28 ± 0,35
  	После обработки:
  	4 ч	78,30	2,65 ± 0,17	0,86 ± 0,10	3,51 ± 0,27
  	4-е сут	73,08	1,40 ± 0,08	0,70 ± 0,07	2,10 ± 0,15
  Щирица жминдовидная	До обработки	81,40	3,06 ± 0,20	0,81 ± 0,09	3,87 ± 0,29
  	После обработки:
  	4 ч	80,40	2,82 ± 0,19	0,72 ± 0,08	3,64 ± 0,27
  	4-е сут	70,40	1,87 ± 0,12	0,67 ± 0,05	2,54 ± 0,17
  Чистец однолетний	До обработки	79,50	2,82 ± 0,19	0,83 ± 0,09	3,25 ± 0,28
  	После обработки:
  	4 ч	78,40	2,76 ± 0,18	0,63 ± 0,04	3,67 ± 0,22
  	4-е сут	71,40	1,29 ± 0,07	0,60 ± 0,03	1,89 ± 0,10
  Конопля сорная	До обработки	80,70	2,60 ± 0,16	0,94 ± 0,12	3,54 ± 0,28
  	После обработки:
  	4 ч	79,60	1,67 ± 0,10	0,68 ± 0,06	2,30 ± 0,16
  	4-е сут	70,20	1,59 ± 0,09	0,60 ± 0,04	2,19 ± 0,13
  	Смесь Гранстар + Дезормон
  Ширица запрокинутая	До обработки	83,10	3,42 ± 0,24	0,97 ± 0,14	4,49 ± 0,38
  	После обработки:
  	4 ч	81,60	2,74 ± 0,18	0,86 ± 0,10	3,76 ± 0,28
  	4-е сут	73,00	1,59 ± 0,06	0,69 ± 0,06	2,19 ± 0,15
  Щирица жминдовидная	До обработки	81,40	3,32 ± 0,22	1,01 ± 0,15	4,33 ± 0,37
  	После обработки:
  	4 ч	80,90	2,96 ± 0,20	0,90 ± 0,12	3,86 ± 0,32
  	4-е сут	69,60	1,41 ± 0,08	0,67 ± 0,05	2,08 ± 0,13
  Чистец однолетний	До обработки	78,50	2,42 ± 0,08	0,83 ± 0,09	3,35 ± 0,17
  	После обработки:
  	4 ч	76,00	2,08 ± 0,14	0,60 ± 0,04	2,68 ± 0,18
  	4-е сут	70,40	1,57 ± 0,09	0,52 ± 0,02	2,09 ± 0,11
  Конопля сорная	До обработки	80,90	2,97 ± 0,20	1,09 ± 0,16	4,06 ± 0,36
  	После обработки:
  	4 ч	79,50	2,75 ± 0,18	0,83 ± 0,09	3,58 ± 0,27
  	4-е сут	70,20	1,50 ± 0,09	0,61 ± 0,04	2,11 ± 0,13
  Р = 0,01.

• 2.    Абсорбция света в хлоропластах и содержание хлорофилла в листьях яровой мягкой пшеницы сорта Башкирская 24 под влиянием обработки гербицидом Трезор и биопрепаратом Стифун

  Вариант обработки	Коэффициент	Содержание хлорофилла, мг/дм2
  	абсорбции, %	а           1        b       1            а + b

  Контроль	Ч е р е з 1 79,67	с у т	п о с л е о б р а б о т к и 3,43 ± 0,15	1,03 ± 0,02	4,46 ± 0,2
  Стифун	80,32		3,82 ± 0,18	1,63 ± 0,10	5,45 ± 0,3
  Трезор	77,94		2,26 ± 0,06	1,69 ± 0,12	3,95 ± 0,2
  	Ч е р е з 4	с у т	п о с л е о б р а б о т к и

• 3.    Активность лектинов, коэффициенты листовой абсорбции и содержание хлорофилла в листьях яровой мягкой пшеницы сорта Башкирская 24 под влиянием обработки гербицидом Луварам и смесью гербицид Луварам + биостимулятор Гуми

  Вариант обработки	Коэффициент  аб сорбции, %	Суммарное содержание хлорофил-ла а + b, мг/дм2	Активность   лектинов, ЕА/мг белка
  Контроль (до обработки)                     79,60 ± 1,52 Через 1 сут после		3,54 ± 0,10 о б р а б о т к и	23,2 ± 0,4
  Контроль	80,00 ± 1,58	3,64 ± 0,12	23,2 ± 0,5
  Луварам	77,69 ± 1,42	3,54 ± 0,11	24,6 ± 0,4
  Луварам + Гуми	80,00 ± 1,58	3,64 ± 0,12	23,2 ± 0,4
  Гуми                                        81,23 ± 1,60 Через 2 сут после		4,28 ± 0,20 о б р а б о т к и	23,7 ± 0,5
  Контроль	80,20 ± 2,10	3,86 ± 0,15	24,1 ± 0,5
  Луварам	77,10 ± 1,42	3,04 ± 0,10	25,4 ± 0,5
  Луварам + Гуми	81,22 ± 1,10	4,00 ± 0,19	24,9 ± 0,5
  Гуми                                        81,44 ± 1,62 Через 3 сут после		4,03 ± 0,20 о б р а б о т к и	25,1 ± 0,5
  Контроль	81,32 ± 1,60	3,98 ± 0,15	25,4 ± 0,6
  Луварам 96	76,50 ± 1,40	2,86 ± 0,09	27,3 ± 0,7

  Луварам + Гуми	81,40 ± 1,62	4,13 ± 0,19	26,2 ± 0,7
  Гуми	81,80 ± 1,68	4,62 ± 0,29	26,8 ± 0,7
  	Ч е р е з 4 с у т п о с л е	о б р а б о т к и
  Контроль	81,97 ± 1,70	4,08 ± 0,18	26,3 ± 0,7
  Луварам	76,28 ± 1,38	2,64 ± 0,08	27,0 ± 0,7
  Луварам + Гуми	81,80 ± 1,68	4,42 ± 0,22	27,4 ± 0,7
  Гуми	82,02 ± 1,69	4,84 ± 0,28	28,5 ± 0,8
  	Через 5 сут после	о б р а б о т к и
  Контроль	82,20 ± 1,50	4,06 ± 0,18	26,4 ± 0,5
  Луварам	78,42 ± 1,50	3,10 ± 0,10	26,8 ± 0,5
  Луварам + Гуми	81,90 ± 1,70	4,62 ± 0,26	27,1 ± 0,6
  Гуми	82,50 ± 1,82	4,98 ± 0,30	29,3 ± 0,8
  	Через 6 сут после	о б р а б о т к и
  Контроль	82,40 ± 1,72	4,36 ± 0,18	26,8 ± 0,6
  Луварам	80,32 ± 1,60	3,82 ± 0,14	27,3 ± 0,7
  Луварам + Гуми	82,60 ± 1,84	4,86 ± 0,29	30,1 ± 0,8
  Гуми	83,20 ± 1,90	5,20 ± 0,33	31,3 ± 0,9
  	Через 7 сут после	о б р а б о т к и
  Контроль	82,50 ± 1,70	4,63 ± 0,25	27,1 ± 0,7
  Луварам	82,48 ± 1,80	4,62 ± 0,26	27,1 ± 0,7
  Луварам + Гуми	83,60 ± 1,92	5,10 ± 0,32	28,3 ± 0,8
  Гуми	83,70 ± 1,93	5,94 ± 0,36	32,3 ± 1,0
  П р и м е ч а н и е.	Описание вариантов опыта см. в разделе «Методика». Р = 0,01.

В первые сутки после обработки гербициды ингибировали биосинтез в листьях не только сорняков, но и растений пшеницы. В течение первых 4-х сут после обработки гербицидом Трезор интенсивность накопления хлорофилла в растениях пшеницы снижалась (табл. 2).

Контроль	80,02	3,38 ± 0,14	1,28 ± 0,07	4,66 ± 0,2
Стифун	80,91	4,09 ± 0,22	1,54 ± 0,09	5,63 ± 0,3
Трезор	78,15	3,15 ± 0,12	1,12 ± 0,04	4,27 ± 0,2
	Ч е р е з 14 с у т	п о с л е о б р а б о	т к и
Контроль	79,00	3,60 ± 0,18	1,54 ± 0,09	5,34 ± 0,2
Стифун	80,00	4,18 ± 0,22	1,62 ± 0,10	5,80 ± 0,3
Трезор	78,70	4,22 ± 0,23	1,44 ± 0,08	5,64 ± 0,3
	Ч е р е з 35 с у т	п о с л е о б р а б о	т к и
Контроль	79,69	2,82 ± 0,09	1,06 ± 0,03	3,88 ± 0,1
Стифун	81,58	4,01 ± 0,20	1,52 ± 0,09	5,53 ± 0,3
Трезор	80,90	3,72 ± 0,18	1,25 ± 0,06	5,07 ± 0,2

П р и м е ч а н и е. Описание вариантов опыта см. в разделе «Методика». Р = 0,01.

На 14-е сут содержание хлорофилла в листьях растений в опыте и контроле было одинаковым; через 1 мес — в опыте выше, чем в контроле. При увеличении содержания зеленых пигментов коэффициент абсорбции листьев растений пшеницы, обработанных этими препаратами, повышался. В то же время применение гербицидов в смеси с биопрепаратами способствовало увеличению абсорбции ХБК в хлоропластах растений пшеницы как в первые сутки после обработки, так и в последействии.

Обработка посевов яровой пшеницы гербицидом Луварам в смеси с Гуми способствовала не только уничтожению сорняков, но и улучшению оптических свойств ХБК, о чем свидетельствует повышение коэффициента абсорбции и содержания хлорофилла а и b в листьях (табл. 3). Эта смесь обладала достаточно высокой селективностью по отношению к растениям яровой пшеницы, снижая отрицательное воздействие гербицидов. Так, под влиянием гербицида Трезор в листьях растений пшеницы увеличивалось диффузное отражение света. После обработки растений этим гербицидом совместно с Гуми в фазах кущения и выхода в трубку коэффициенты диффузного отражения света листьями уменьшались, приближаясь к таковым в контроле.

Через 2 сут после обработки растений пшеницы в фазе кущения гербицидом Луварам (1,5 л/га) активность лектинов в листьях резко увеличивалась (см. табл. 3). Это, возможно, связано с тем, что лектины выполняют роль связывающих белков, различающихся по константе связывания с гербицидом. В таком случае каждому лектину должен соответствовать свой акцептор, а гербицид будет связываться разными регуляторными фракциями лектинов и включать различные программы транскрипции.

Показано, что разрушение натриевой соли 2,4-Д в относительно устойчивых к этому гербициду растениях пшеницы происходит за сравнительно короткий промежуток времени в результате быстрого проникновения в корни, сопровождающегося выведением из растения препарата или переходом последнего в неактивную форму (12).

Повышение содержания лектинов при обработке растений гербицидами дает основание предполагать, что эти белки принимают участие в связывании и активной транспортировке гербицидов. Коэффициент абсорбции света листьями, а также суммарное содержание хлорофилла а + b в хлоропластах под воздействием гербицида снижались. При обработке растений Луварамом в смеси с Гуми (75 г/га) наблюдалось повышение активности лектинов (см. табл. 3). Через 3 сут и в последующие 3 сут выявлено снижение активности лектинов, свидетельствующее о постепенной детоксикации растений от введенного гербицида.

Применение гербицида Луварам совместно с биостимулятором Гуми не вызывало уменьшения абсорбции света ХБК и суммарного содержания хлорофилла а + b , однако увеличивалась активность лектинов. Возможно, что использование Гуми оказывало влияние на гемагглютинирующую активность лектинов и способствовало не только быстрому переходу гербицида в неактивную форму, но и выведению его из растения через корни.

Как известно, пестициды оказывают влияние на транскрипцию ДНК, в результате чего содержание РНК в клетках уменьшается. Содержание ДНК, РНК, белка и лектинов в листьях растений пшеницы через 1 сут после обработки гербицидом Луварам заметно снижалось (табл. 4). Функциональная активность ДНК уменьшалась, что замедляло синтез РНК и белка. Так, содержание ДНК, РНК, белка и лектинов в опыте составляло соответственно 3,18 ⋅ 10^–1; 2,61; 354,00 и 30,00 мг/дм²; в контроле — соответственно 3,23 ⋅ 10^–1; 3,50; 531,66 и 33,00 мг/дм². Через 2 нед в растениях, обработанных гербицидом, не только восстанавливался обмен нуклеиновых кислот и белка, но и усиливался биосинтез ДНК, РНК, белка и лектинов, причем в большей степени это касалось функциональной активности ДНК. Коэффициент РНК/ДНК в опыте составлял 12,6 (контроль — 11,2). При этом содержание РНК в листьях пшеницы увеличивалось, однако функциональная активность РНК уменьшалась, что обусловливало незначительное увеличение содержания белка в листьях.

Вариант обработки

ДНК

РНК

Белок

РНК/ДНК

Лектины

РНК/белок, ½10–2

Контроль	3,23 ± 0,2	Через 1 сут после обработки			0,66 ± 0,04	33,9
		35,02 ± 2,8	531 ± 25	10,9
Луварам + Гуми	4,11 ± 0,6	47,75 ± 4,1	573 ± 30	11,6	0,83 ± 0,06	34,8
Луварам	3,18 ± 0,2	26,07 ± 1,8	354 ± 15	14,0	0,74 ± 0,12	30,0

Через 4 сут после обработки

Контроль	3,82 ± 0,4	41,56 ± 3,2	585 ± 31	12,8	0,71 ± 0,05	37,0
Луварам + Гуми	5,73 ± 0,1	98,62 ± 8,1	661 ± 38	17,6	1,49 ± 0,14	39,1
Луварам	3,54 ± 0,3	34,56 ± 2,6	396 ± 17	15,1	0,87 ± 0,08	32,2
		Ч е р е з 14 с у т	п о с л е	о б р а б о т к и
Контроль	3,97 ± 0,5	44,57 ± 3,5	583 ± 31	11,2	0,76 ± 0,06	40,6
Луварам + Гуми	6,72 ± 0,1	92,08 ± 7,8	698 ± 40	13,7	1,32 ± 0,12	58,3
Луварам	5,66 ± 0,9	71,06 ± 6,1	622 ± 39	12,6	1,14 ± 0,10	43,6

П р и м е ч а н и е. Описание вариантов опыта см. в разделе «Методика».

Регуляторы роста интенсивно включаются в процессы метаболизма и быстро транспортируются в растениях. Использование баковой смеси гербицида Луварам и биостимулятора роста Гуми снижало отрицательное действие гербицида и стимулировало обмен нуклеиновых кислот и белка в клетках обработанных растений. Незначительное ингибирование процессов накопления ДНК, РНК и белка в клетках растений нивелировалось при использовании смеси гербицида с биостимуляторами. Так, содержание ДНК в растениях через 1 сут после обработки возрастало по сравнению с контролем, РНК и общего белка — заметно снижалось, тогда как активность лектинов увеличивалась (см. табл. 4). При использовании Гуми выявлена следующая зависимость: уже через 4 сут после обработки увеличивалось содержание ДНК, РНК, белка и лектинов; спустя 2 нед возрастала функциональная активность ДНК. В целом наши данные свидетельствуют о том, что под воздействием гербицидов содержание нуклеиновых кислот в растениях снижается, причем в большей степени это касается содержания РНК. Возможно, что действие на растения различных факторов среды (в том числе и гербицидов) обусловлено скоростью синтеза и распада РНК.

Таким образом, при выборе и использовании в качестве протектантов наиболее эффективных препаратов мы предлагаем руководствоваться данными о механизме действия антистрессовых индукторов, повышающих неспецифическую устойчивость растений к гербицидам. Наряду с гуминовыми кислотами в качестве таких препаратов могут служить эмистим, иммуноцитофит, эпин, агат-25, а также фитоспорин (13, 14). Сроки действия разных антистрессовых препаратов варьируют до 3 нед и более. Повторная обработка этими препаратами в разных сочетаниях в течение онтогенеза является важным способом дополнительного повышения устойчивости растений к действию и других неблагоприятных факторов.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    И с а е в а Л.И. Повышение безопасности гербицидов для культурных растений (зарубежный опыт). В сб.: Агропромышленное производство: опыт, проблемы и тенденции развития. М., 1988, 1: 35-44.

• 2.    Ш а я х м е т о в И.Т., К у з н е ц о в В.И., Г и л я з е т д и н о в Ш.Я. Перспективы использования Гуми в качестве протекторного препарата против токсического действия гербицидов. В кн.: Защитно-стимулирующие и адаптогенные свойства препарата Гуми — биоактивированной формы гуминовых кислот. Уфа, 2000: 50-56.

• 3.    В е ч е р А.С. Основы физической биохимии растений. Минск, 1984.

• 4.    L i s k e r J.S. Nev physical methodes and system for automatic determination of state of plant and seeds. In: Automatic control of food and biological processes. Paris, 1994: 75-82.

• 5.   Л у ц и к М.Д., П а н а с ю к Е.Н. Лектины. Львов, 1981.

• 6.   L i s H., S h a r o n N. Lectins in higher-plants. Biochemistry of plants. N.Y., 1981, 6: 371-444.

• 7.    С п и р и н А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия, 1958, 23, 5: 656-662.

• 8.    К о н а р е в В.Г., Т ю т е р е в С.Л. Методы биохимии и цитохимии нуклеиновых кислот растений. Л., 1970.

• 9.    B r a d f o r d M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem., 1976, 72, 1/2: 248-254.

• 10.    L o w r y O.H., R o s e b r o u g h N.J., F a i r A.L. e.a. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, 193, 1: 265-275.

• 11.    С т р е л к о в В.Д. Поиск новых регуляторов роста растений и гербицидных антидотов. В сб.: Актуальные вопросы биологизации растений. Пущино, 2000: 152-155.

• 12.    П и т и н а М.Р., П о з н а н с к а я Н.Л., П р о м о н е н к о в В.К. Современный уровень и перспективные направления защиты сельскохозяйственных культур от нежелательных последствий применения гербицидов. Агрохимия, 1986, 4: 107-139.

• 13.    К у л ь н е в А.И., С о к о л о в а Е.А. Многоцелевые стимуляторы защитных реакций, роста и развития растений. Пущино, 1997.

• 14.    М е н л и к е е в М.Я., Х о т я н о в и ч И.В. Элита Фитоспорин — высокоэффективный препарат комплексного действия. Екатеринбург, 2001.

Башкирский государственный университет ,