Физиолого-биохимические ответы растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.), зараженных грибом Alternaria alternata, на применение микробных препаратов на основе Bacillus subtilis

Болезни листьев, вызванные патогенными грибами рода Alternaria , значительно снижают продуктивность и качество растений сахарной свеклы ( Beta vulgaris L.) — одной из наиболее важных сахароносных культур, которая служит источником сырья для сахарной, пищевой, кондитерской, 958

спиртовой промышленности, производства биоэтанола, удобрений, кормов для животных (1). У пораженных растений развивается альтернариоз, для которого характерно образование пятнистостей на поверхности листьев (2). Нарушаются физиологические функции, изменяются анатомо-морфологические показатели, снижается продуктивность, отмирают отдельные части растений, происходит их полная гибель (3). Преждевременные потери ассимиляционной площади листового аппарата, вызванные альтер-нариозом, приводят к утрате пластических веществ корней, затраченных на новообразование листьев, замедляется нарастание массы корнеплодов, в них снижается содержание сахарозы (2).

Преимущества использования для оздоровления растений биологических препаратов в сравнении с химическими средствами защиты заключаются в экологической безопасности и системном иммуномодулирующем действии (3, 4). К перспективным агентам биоконтроля и активаторам иммунитета растений относятся микробные препараты на основе бактерий Bacillus subtilis , обладающих антагонизмом к патогенным микроорганизмам и положительно влияющих на продуктивность культур (4-6). Ростостимулирующий и протекторный эффекты этих препаратов показаны на многих видах растений (7-9) и в отношении различных стрессовых факторов биотической и абиотической природы (10-12). Считается, что такое действие обусловлено способностью B. subtilis продуцировать биологически активные вещества (инсектицидные и антимикробные компоненты, фитогормоны, сидерофоры и хелаторы) (13-15), снижать содержание этилена в растениях, улучшать фиксацию азота, усвояемость макро- и микроэлементов (16), запускать механизмы системной устойчивости растений в ответ на стрессы (17) посредством активации салицилат- и жасмонат-зависимых сигнальных путей (18-20).

Важную роль в индукции устойчивости растений к патогенам играют гидролитические ферменты (амилазы, пектиназы, протеазы) и их ингибиторы (21-23). На модельных растениях картофеля и сахарной свеклы показано, что внесение биопрепаратов на основе B. subtilis способствует активации синтеза ингибиторов протеаз и защищает растения от проникновения и развития патогенных микроорганизмов (6). О развитии защитных реакций растений к стрессам разной природы можно также судить по степени накопления в них пролина и сахаров, служащих маркерами формирования устойчивости в экстремальных ситуациях (24-26). В то же время, несмотря на значительный объем экспериментальных данных, последовательность развития защитных механизмов, индуцируемых B. subtilis , до конца не ясна. Начиная свои исследования, мы не располагали сведениями о влиянии B. subtilis на фотосинтетическую активность листьев сахарной свеклы как интегральную характеристику физиологического состояния всего растения и о характере изменений в содержании пролина и сахаров в листьях в условиях заражения возбудителями альтернариоза.

В результате проведенных исследований мы впервые выявили, что внесение биологических препаратов на основе Bacillus subtilis препятствует снижению фотосинтетической активности листового аппарата сахарной свеклы, индуцированному возбудителем альтернариоза, и инициирует защитные реакции, включающие активацию ингибиторов гидролитических ферментов, повышение содержания пролина и сахаров. Это снижает повреждающее действие патогенного гриба A. alternata на растения сахарной свеклы и способствует формированию более крупных корнеплодов.

Цель работы заключалась в оценке влияния биопрепаратов фито-спорин-М, витаплан и штамма Bacillus subtilis 10-4 на физиолого-биохи- мические показатели и продуктивность сахарной свеклы при заражении Alternaria alternata.

Методика . Исследования выполняли на растениях сахарной свеклы Beta vulgaris L. сорта Кампаи (ООО «АгроСем-Инвест», г. Краснодар). В опытах использовали биопрепараты фитоспорин-М ( B. subtilis 26D, НВП «БашИнком», г. Уфа) (П, 30 г/10 л), витаплан ( B. subtilis 2604D + B. sub-tilis 2605D, ЗАО «Агробиотехнология», Россия) (СП, 20 г/га) и новый штамм B. subtilis 10-4, выделенный в Башкирском НИИ сельского хозяйства (10⁵ КОЕ/мл) (8). Растения опрыскивали суспензиями биопрепаратов 2-кратно — в фазу 2-3 пар и 4-6 пар настоящих листьев. Расход рабочей жидкости составлял 300 л/га.

Полевые опыты проводили в Предуральской степной зоне Республики Башкортостан (OOO «Чишмы агроинвест») в 2013 году на мелких делянках (5 м²). Почва на опытном поле — чернозем выщелоченный (рН 5,25), Hg — 5,50 мг-экв/100 г почвы, содержание гумуса — 8,69 %, калия и фосфора — соответственно 29,0 и 23,0 мг/100 г. Сахарную свеклу высаживали в сроки, общепринятые для региона, появление всходов отмечали на 12-14-е сут. Всходы искусственно заражали, нанося на листья по 100 мкл суспензии гриба A. alternata (10⁶ КОЕ/мл). Степень развития болезни оценивали визуально в течение вегетации по 5-балльной шкале: 0 баллов — отсутствие симптомов, 1 балл — поражение от 1 до 25 % площади листа, 2 балла — от 26 до 50 %, 3 балла — от 51 до 75 %, 4 балла — более 75 %.

В течение вегетации трижды (фазы 4-6 пар настоящих листьев, смыкания листьев в рядках, технической спелости) отбирали контрольные (необработанные, здоровые) и опытные (обработанные биопрепаратами и зараженные A. alternata ) целые растения или отдельно корнеплоды и побеги для оценки физиолого-биохимических показателей.

Содержание хлорофиллов a и b определяли согласно S.W. Jefferey с соавт. (27). Образцы листьев взвешивали, измельчали, перетирали в ступке с добавлением углекислого кальция и 90 % ацетона (из расчета 0,05 г листьев на 10 мл ацетона), полученный экстракт фильтровали. Оптическую плотность растворов экстрагированных пигментов измеряли при λ = 436 нм и λ = 680 нм на спектрофотометре UV-2401PC («Shimadzu», Япония). Концентрацию каротиноидов в суммарной вытяжке пигментов вычисляли по формуле P. Wettstein (28).

Образование пролина в листьях оценивали по методике L.S. Bates с соавт. (29) в модификации Л.Г. Калинкиной (30). Для этого брали по 2 г исследуемого материала и заливали 2,5 мл кипящей дистиллированной воды. Пробирки доводили до кипения в водяной бане и охлаждали. Затем пробирки с 2 мл холодной пробы, 2 мл нингидринового реактива, 2 мл ледяной уксусной кислоты помещали в водяную баню, кипятили 1 ч и охлаждали. Интенсивность окрашивания комплекса пролина с нингидрином определяли при λ = 522 нм на спектрофотометре СФ-26 («ЛОМО», Россия). Содержание пролина устанавливали по калибровочной кривой, используя стандартные растворы химически чистого L-пролина («Sigma Aldrich», США).

Ферментативную активность протеиназ, амилаз и их ингибиторов определяли спектрофотометрическим методом (21, 31), накопление сахара в листьях — фотометрическим методом с применением 2,4-динитрофенола по ГОСТ Р 51636-2000, количество сахарозы в корнеплодах — методом холодного водного дигерирования с использованием поляриметра П161-М (Россия) (32). Площадь поверхности листьев измеряли с помощью фотопланиметра, массу надземной части растений и массу корнеплодов — ве- совым методом (33).

Все опыты проводили в 3-4 биологических и 4-5 аналитических повторах. Статистическую обработку выполняли с использованием компьютерной программы STATISTICA 6.0 («StatSoft, Inc.», США). На рисунках и в таблицах представлены средние значения ( M ) и их стандартные отклонения (±SD) при Р = 0,95.

Результаты . Альтернариоз поражает листовую поверхность растений, образуя пятнистости, и приводит к уменьшению фотосинтетической поверхности листьев (2). Фотосинтез — главный процесс при формировании продуктивности растений, от его интенсивности зависит общая биологическая урожайность культур (34). В свою очередь, содержание основных фотосинтетических пигментов (хлорофиллов а, b и каротиноидов) служит одним из косвенных индексов фотосинтетической активности и важнейшим биохимическим показателем растения, определяющим интенсивность фотосинтеза (24, 34). В наших опытах инфицирование сахарной свеклы A. alternata приводило к снижению в листьях содержания хлорофилла а (до 1,5-кратного) и b (до 1,2-кратного) по сравнению со здоровыми растениями (рис. 1), что свидетельствует о нарушении процесса фотосинтеза и уменьшении фотосинтетической деятельности растений.

Рис. 1. Содержание хлорофилла а (А) , хлорофилла b (Б) , каротиноидов (В) и площадь листовой пластинки (Г) у здоровых (I) и инфицированных Alternaria alternata (II) растений сахарной свеклы Beta vulgaris L. сорта Кампаи при использовании биопрепаратов: 1 — контроль, 2 — фитоспорин-М, 3 — витаплан, 4 — штамм Bacillus subtilis 10-4; а — первая обработка, б — вторая обработка, в — уборка урожая (OOO «Чишмы агроинвест», Республика Башкортостан, 2013 год).

Инокуляция штаммом B. subtilis 10-4 и обработка биопрепаратами фитоспорин-М и витаплан восстанавливала фотосинтетическую деятельность растений. Так, 2-кратная обработка биопрепаратами предотвращала индуцированное стрессом снижение содержания хлорофиллов а и b во всех вариантах опыта (см. рис. 1, А, Б). Содержание каротиноидов в листьях при заражении A. alternata увеличивалось (см. рис. 1, В). Обработка витапланом и штаммом B. subtilis 10-4 способствовала снижению их количества, тогда как после двух обработок фитоспорином-М наблюдалось значительное накопление каротиноидов, превышавшее контрольные значения. Однако к уборке содержание каротиноидов снижалось и было сопоставимо с таковым в вариантах, в которых применялись витаплан и штамм 10-4 (см. рис. 1, В). Следует отметить, что в незараженных растениях 2-кратная обработка биопрепаратами хоть и приводила к незначительному повышению количества каротиноидов, но к уборке этот показатель был ниже, чем в контрольном варианте (см. рис. 1, В).

Внесение биопрепаратов в нормальных условиях произрастания стимулировало фотосинтетическую деятельность растений, вероятно, за счет увеличения содержания физиологически активного хлорофилла a. Действительно, результаты, полученные при оценке площади поверхности листьев (см. рис. 1, Г), коррелировали с данными о влиянии исследуемых препаратов на содержание хлорофиллов a и b. Растения, обработанные препаратами, во всех вариантах в течение всего вегетационного периода характеризовались значительно большей площадью листовой пластинки как в норме, так при заражении A. alternata (см. рис. 1, Г).

Очевидно, что выявленное увеличение содержания фотосинтетических пигментов при использовании биопрепаратов в условиях инфицирования A. alternata (см. рис. 1, А, Б, В), помимо их непосредственной роли в процессе фотосинтеза и увеличении размеров листьев (см. рис. 1, Г), может вносить вклад в развитие защитных реакций растений (34). В частности, каротиноиды выполняют фотопротекторную и антиоксидантную функции (35-38), предотвращая повреждения, вызываемые образованием синглетного кислорода и триплетного хлорофилла (37). К тому же они могут принимать энергию возбуждения триплетного хлорофилла, а затем рассеивать ее в виде тепла или гасить молекулы синглетного кислорода (38, 39). Однако следует отметить, что, несмотря на очевидную роль каротиноидов в антиоксидантной защите растений, данные об изменении их содержания при действии стрессовых воздействий весьма противоречивы (22, 24, 36). Подобные эффекты могут объясняться, с одной стороны, индукцией образования каротиноидов под действием стресс-фактора, с другой — его усиленной деградацией при сильном стрессе (22).

Вместе с тем при формировании защитных реакций растений к патогенам значительную роль играют гидролитические ферменты (протеазы, амилазы) и их ингибиторы (21). При инфицировании A. alternata происходило повышение активности протеиназ и амилаз (рис. 2, Б, Г) в листьях сахарной свеклы, что свидетельствует об интенсивном развитии патогена в тканях растений. Вероятно, этот процесс был обусловлен изменениями метаболизма растения-хозяина под воздействием патогена, а также секрецией самим патогеном гидролитических ферментов, способных мацерировать ткани и разрушать компоненты клеточной стенки, что позволяет патогену преодолевать естественную резистентность растения-хозяина. Растения, обработанные штаммом B. subtilis 10-4, фитоспорином-М и вита-планом характеризовались снижением активности гидролаз как в зараженных, так и в здоровых листьях (см. рис. 2, А-Г), причем наибольшее снижение гидролитической активности наблюдалось в вариантах с использованием препарата фитоспорин-М и штамма B. subtilis 10-4.

Значимый вклад в регуляцию активности гидролитических ферментов вносят белковые ингибиторы растения, подавляющие активность собственных и чужеродных ферментов, в частности патогенных грибов и бактерий (23, 40). В ответ на инфицирование A. alternata в листьях сахарной свеклы активность ингибиторов гидролаз снижалась (см. рис. 2, Е, З), вследствие чего, вероятно, уменьшалась сопротивляемость растений к действию ферментов патогена и его распространению в тканях. Обработка исследуемыми препаратами, напротив, способствовала увеличению активности ингибиторов гидролаз (см. рис. 2, Е, З), что указывает на индуциро-962

вание у растений под их влиянием защитных реакций против А. alternatа . Следует отметить, что максимальную активацию защитных белков вызывало применение штамма B. subtilis 10-4 и фитоспорина-М.

Рис. 2. Активность протеиназ (A, Б) , амилаз (В, Г) , ингибиторов протеиназ (Д, Е ) и ингибиторов амилаз (Ж, З) в листьях у здоровых (А, В, Д, Ж) и инфицированных Alternaria alternata (Б, Г, Е, З) растений сахарной свеклы Beta vulgaris L. сорта Кампаи при использовании биопрепаратов: а — контроль, б — фитоспорин-М, в — витаплан, г — штамм Bacillus subtilis 10-4; I — первая обработка, II — вторая обработка, III — уборка урожая (OOO «Чишмы агроинвест», Республика Башкортостан, 2013 год).

Важными биохимическими маркерами формирования устойчивости могут выступать накопление в растительной массе сахара и пролина (31). Здоровые растения B. vulgaris постепенно накапливали сахар в листьях в течение всей вегетации (рис. 3, А), что было вполне характерно и согласовывалось с имеющимися в литературе данными (41). Наибольшую скорость накопления сахара наблюдали на первоначальных этапах роста, когда растение энергично формировало листья и корни, и замедлялась к концу образования третьей пары настоящих листьев. По-видимому, это было связано с тем, что в фазу смыкания рядков прирост листьев замедлял- ся, происходило интенсивное утолщение и формирование корнеплодов, сопровождавшееся продолжением накопления сахаров в них.

Инфицирование A. alternata приводило к резкому повышению содержания сахара в листьях по сравнению с показателями у контрольных здоровых растений, что, по-видимому, выполняет протекторную роль и позволяет растениям продолжать рост в стрессовых условиях (см. рис. 3, Б). Этому могут способствовать свойства моносахаридов, связанные с повышением стабильности биомембран, антиденатурационным воздействием на белки и антиоксидантным эффектом (42). Кроме того, накапливающиеся углеводы помогают поддерживать осмотический статус клеток (33).

Рис. 3. Содержание сахара (А, Б) и пролина (В, Г) в листьях у здоровых (А, В) и инфицированных Alternaria alternata (Б, Г) растений сахарной свеклы Beta vulgaris L. сорта Кампаи при использовании биопрепаратов: а — контроль, б — фитоспорин-М, в — витаплан, г — штамм Bacillus subtilis 10-4; I — первая обработка, II — вторая обработка, III — уборка урожая (OOO «Чишмы агроинвест», Республика Башкортостан, 2013 год).

Один из наиболее многофункциональных стрессовых метаболитов растений — аминокислота пролин, выполняющая роль не только осмолита и антиоксиданта (24, 43), но и низкомолекулярного шаперона (40), участвующего в поддержании нативной структуры ферментов (24). Во многих исследованиях сообщалось о повышении содержания пролина в растениях в ответ на воздействие стрессов различной природы и о его значении как фактора, важного для выживания растений в экстремальных ситуациях (24-26). Однако данных об изменениях содержания пролина в растениях сахарной свеклы в условиях инфицирования A. alternata и использования препаратов на основе B. subtilis мы в доступной литературе не обнаружили.

Инфицирование сахарной свеклы A. alternata приводило к значительному повышению содержания в растениях пролина (см. рис. 3, Г). В то же время обработка фитоспорином-М, витапланом и штаммом B. sub-tilis 10-4 способствовала предотвращению его накопления, индуцированного стрессом (см. рис. 3, Г). Следует отметить, что под влиянием биопрепаратов в здоровых растениях также наблюдалось незначительное повышение количества пролина, что дополнительно указывает на важную роль этого агента в формировании индуцированной устойчивости к возбудителю альтернариоза (см. рис. 3, В).

Совокупным показателем характера физиолого-биохимических про- цессов за весь период вегетации могут служить данные о внешнем состоянии растений и продуктивности корнеплодов. В нашем опыте искусственное заражение растений грибом A. alternata приводило к постепенному увеличению площади пораженной альтернариозом листовой поверхности. Так, к уборке урожая ее доля достигала 75 % и более (4 балла), в то время как у растений, обработанных штаммом B. subtilis 10-4, фитоспорином-М, витапланом, она не превышала 35 % (2 балла). Наилучший эффект отмечали в вариантах с использованием штамма B. subtilis 10-4 и биопрепарата фитоспорина-М. В этих случаях степень развития болезни не превышала соответственно 25 и 30 %. Вместе с тем 2-кратная обработка биопрепаратами приводила к достоверному увеличению средней массы надземной части здоровых растений в 1,8-2,7 раза и средней массы корнеплодов — в 1,6-2,3 раза в зависимости от варианта опыта (табл.). Обработка биопрепаратами предотвращала стресс-индуцированное снижение показателей продуктивности корнеплодов в условиях заражения A. alternata и способствовала сохранению роста массы листьев и корнеплодов, сопоставимого с таковым у здоровых растений.

Накопление массы листьев и корнеплодов у растений сахарной свеклы ( Beta vulgaris L.) сорта Кампаи под влиянием микробных препаратов на основе Bacillus subtilis в норме и при инфицировании Alternaria alternata

Вариант	Масса наземной части, г			Масса корнеплодов, г
	I обработка	II обработка	уборка урожая	I обработка	II обработка	уборка урожая
Контроль	4,45±0,19	Зд 14,67±0,77	оровые 165,20±2,65	0,52±0,09	4,33±0,30	550,80±10,41
Фитоспорин-М	6,11±0,30	27,96±0,82	304,80±2,32	0,92±0,19	10,42±0,48	971,00±11,89
Витаплан	7,75±0,51	14,25±0,46	425,40±3,01	1,17±0,28	4,94±0,12	970,60±13,03
Bacillus subtilis 10-4	11,00±0,42	36,70±0,91	336,40±4,69	1,80±0,12	14,12±0,22	1142,40±12,62
A. alternata	6,86±0,22	Зар 14,14±1,13	аженные 71,20±1,78	1,32±0,09	3,37±0,21	276,30±4,11
Фитоспорин-М	8,84±0,14	15,61±0,91	182,00±1,99	1,81±0,12	7,11±0,29	463,00±5,33
Витаплан	4,68±0,49	11,84±0,70	127,40±2,06	0,64±0,11	3,98±0,15	502,20±5,09
Bacillus subtilis 10-4	11,21±0,30	25,70±1,42	209,40±2,57	2,72±0,23	11,66±0,23	607,20±4,95

Помимо положительного влияния на интенсивность ростовых процессов и накопление биомассы, 2-кратное внесение биопрепаратов обеспечило получение корнеплодов с более высоким содержанием сахарозы в сравнении с контролем и у здоровых, и у зараженных растений. Так, к моменту уборки урожая в контрольном варианте корнеплоды содержали 16,1 % сахарозы, в опытных вариантах — от 17,9 до 19,0 %. Максимальное количество сахарозы было зафиксировано в вариантах с 2-кратной обработкой посевов фитоспорином-М и штаммом B. subtilis 10-4. В условиях заражения A. alternata корнеплоды растений, обработанных препаратами, во всех вариантах характеризовались повышенным содержанием сахарозы в сравнении с необработанными.

Таким образом, препараты фитоспорин-М, витаплан и штамм Bacillus subtilis 10-4 способствуют усилению синтеза фотосинтетических пигментов (хлорофилла a, b и каротиноидов), увеличению активности ингибиторов гидролаз в листьях и снижению стресс-индуцированного накопления пролина и сахара, оказывая защитный эффект в условиях заражения растений сахарной свеклы грибом Alternaria alternata . При обработке микробными препаратами на основе B. subtilis как у здоровых растений, так и в случае заражения A. alternatа повышалась масса корнеплодов и содержание в них сахарозы . Наиболее эффективными оказались варианты с 2-кратным применением фитоспорина-М и штамма B. subtilis 10-4, в которых негативное влияние фитопатогенного гриба A. alternata на растения

максимально нивелировалось и были получены корнеплоды с наибольшей массой и содержанием сахарозы.