Флуоресцентно-гистохимическая характеристика тучных клеток матки крыс в процессе послеродовой инволюции

Введение. В области фундаментальной медицины среди современных исследований одно из ведущих мест занимают работы, посвященные изучению за- кономерностей процессов гистогенеза, регенерации, структурных основ жизнедеятельности органов и тканей [1-2]. Матка является в своем роде уникальным органом вследствие постоянного ремоделирования в течение репродуктивного периода тканей, ее составляющих. В настоящее время актуальной задачей является профилактика послеродовых осложнений. Нарушения инволюционных процессов, происходящих в этом органе после родов, могут стать причиной развития патологических состояний матки [3–6]. Нейромедиаторные биогенные амины принимают активное участие в регуляции тканевого гомеостаза и гистогенеза [7–9], в том числе в процессе инволюции матки [10–12]. Большое значение в обмене биоаминов отводится тучным клеткам (далее – ТК) [78, 13]. В настоящее время изучена роль тканевых базофилов в обеспечении матки крыс биоаминами в течение полового цикла [7]. Практически отсутствуют данные об их локализации, пространственной кооперации и динамики насыщенности биоаминами в течение послеродового периода.

Цель исследования: выявить закономерности пространственной кооперации тучных клеток тела матки крыс и установить содержание в них катехоламинов, серотонина и гистамина в течение послеродового периода.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена в осенне-зимний период на 55 беспородных самках крыс репродуктивного возраста стандартной массы, распределенных по срокам послеродового периода – 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 сутки. На выполнение исследования получено заключение локального этического комитета Ивановской государственной медицинской академии Минздрава России от 09.12.2015 г. (протокол № 6). Материалом исследования явились нефиксированные криостатные срезы тела матки. Животных выводили из опыта путем дислокации шейных позвонков согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минздрава СССР от 13.11.1984 г. № 724).

Для выявления катехоламинов и серотонина в ТК в нефиксированных крио-статных срезах тела матки использован па-раформальдегидный метод Фалька-Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной [14]. Образующийся серотониново-параформальдегидный флуорофор имеет максимумы возбуждения 370–410 нм и эмиссии 520–530 нм. Катехоламины флуоресцируют с максимумами возбуждения и эмиссии, соответственно, 410 и 480–490 нм. Для дифференцировки гистамина в ТК применен флуоресцентногистохимический метод Кросса-Эвана-Роста [15] с использованием ортофталевого альдегида (фирма «MERCK-Schuchardt»); в данном варианте метода гистамин флуоресцирует в желтой области спектра с максимумами возбуждения и эмиссии, соответственно, 365–410 и 515–520 нм.

С целью исключения аутофлуоресценции часть препаратов исследовалась без обработки параформом ортофталевым альдегидом. Препараты, приготовленные по вышеуказанным методам, изучались с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И3, стандартного набора светофильтров, адекватных режиму флуоресценции биоаминов (ЖС-18, ФС 1-2, СЗС 24-4, БС 8-3). Цитоспектрофотометриче-ская установка ФМЭЛ-1А (выходное напряжение 2100В, ФЭУ-73), соединенная с регистрирующим устройством, с помощью отрезных интерференционных фильтров позволяет дифференцировать свечение серотонина, катехоламинов и гистамина и определять количественное содержание биоаминов (в условных единицах). На стандартной площади препарата подсчитывалось количество флуоресцирующих ТК. За одну варианту статистических массивов принималось количество клеток в 10 полях зрения.

Для выявления гликозаминогликанов в ТК осуществлена окраска криостат-ных срезов альциановым синим-сафранином в прописи Дезага [16]. В окрашенных мазках проводилась оценка плотности пространственного распределения ТК методом, аналогичным при подсчете флуоресцирующих клеток. Статистический анализ осуществлялся с помощью приложений платформы MS Exel.

Определялись коэффициенты параметрической и непараметрической корреляций. Достоверность различий математических ожиданий оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Мании Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Результаты исследования и обсуждение. ТК в криостатных срезах, обработанных по методу Фалька-Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной, определяются по характерной желтовато-зеленой флуоресценции гранул, располагаются они преимущественно одиночно. В эндо- метрии ТК располагаются преимущественно в соединительной ткани, некоторые из них локализуются под эпителием слизистой оболочки или непосредственно в нем (рис. 1). Плотность пространственного распределения флуоресцирующих ТК слизистой и мышечной оболочек тела матки минимальна в первые сутки после родов (рис. 2). В это время клетки располагаются в основном периваскулярно, цитоплазма большинства из них плотно заполнена гранулами. В некоторых тканевых базофилах наблюдаются признаки дегрануляции.

а                                               б

Рис. 1. Тучные клетки эндометрия тела матки крыс. Обозначения: а – 2-е сутки после родов, б – 10-е сутки после родов. Окр.: метод Фалька-Хилларпа. Ув.: х900, масляная иммерсия.

К 6-м суткам после родов плотность флуоресцирующих ТК в эндометрии увеличивается примерно в два раза, а в миометрии – в 4 раза (p<0,05). Визуально отмечаются клетки с выраженной дегрануляцией. Максимального уровня плотность ТК достигает максимума к 10-м суткам, за исключением эндометрия, где на 15-е сут-

Рис. 2. Динамика плотности пространственного распределения тучных клеток, флуоресцирующих (ТКФ) и окрашенных по методу Дезага (ТКД) эндометрия (э) и миометрия (м) тела матки крыс в течение послеродового периода. По оси ординат – средняя плотность пространственного распределения тучных клеток, по оси абсцисс – сутки после родов. Достоверность отличий оценочного параметра от такового в предыдущий период исследования p<0,05.

ки отмечается недостоверное увеличение этого параметра по сравнению с 10-ми сутками.

Плотность пространственного распределения ТК, выявляемых при окрашивании срезов альциановым синим-сафранином по Дезага, начиная с 4–5-х суток, достоверно выше, чем плотность флуоресцирующих тканевых базофилов. Динамика плотности клеток, выявляемых данным методом, в течение послеродовой инволюции матки аналогична изменению количества флуоресцирующих ТК (рис. 2).

Рис. 3. Динамика содержания серотонина (СТК) и катехоламинов (КТК) в тучных клетках эндометрия (э) и миометрия (м) тела матки крыс в течение послеродового периода. По оси ординат – среднее содержание моноаминов в у.е., по оси абсцисс – сутки после родов. ☆ – достоверность отличий данного оценочного параметра от такового в предыдущий период исследования p<0,05.

Микроспектрофлуориметрия аль-дегид-индуцированного свечения ТК в препаратах, приготовленных по методу Фалька-Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной, выявляет в них на протяжении всего послеродового периода наличие катехоламинов и серотонина. В тканевых базофилах эндометрия матки наибольшее содержание указанных биоаминов отмечается в первые сутки (рис. 3).

Сразу после родов уровень моноаминов постепенно достоверно снижается. В теле матки уменьшение содержания серотонина продолжается до 4-х суток, а катехоламинов – до 5-х, после чего отмечается увеличение этого показателя до 7-х суток. Минимальные значения уровня моноаминов наблюдаются на 10-е сутки.

В мышечной оболочке ТК чаще располагаются группами, иногда рядом с формирующимися нервными волокнами. Содержание серотонина и катехоламинов в ТК миометрия тела матки максимально в пер- вые сутки после родов (см. рис. 3). Постепенно снижаясь, оно достигает наименьших значений на 15-е сутки послеродовой инволюции.

При обработке криостатных срезов по методу Кросса-Эвана-Роста с целью вы-

Рис. 4. Динамика содержания гистамина в тучных клетках эндометрия (э) и миометрия (м) тела матки крыс в течение послеродового периода. По оси ординат – среднее содержание моноамина в у.е., по оси абсцисс – сутки после родов. ☆ – достоверность отличий данного оценочного параметра от такового в предыдущий период исследования p<0,05.

явлении тканевого гистамина ТК характеризуются интенсивной зеленовато-желтой флуоресценцией гранул. Самый высокий уровень гистамина в ТК эндометрия приходится на первые сутки после родов (рис. 4). Начиная со вторых суток, содержание моноамина волнообразно достоверно снижается, достигая наименьших значений к 10-м и 15-м суткам. Необходимо отметить достоверное увеличение уровня гистамина на 7-е сутки. Аналогичным образом изменяется уровень гистамина в тканевых базофилах миометрия (см. рис. 4). Сравнивая насыщенность гистамином ТК различных оболочек матки в процессе ее послеродовой инволюции, можно отметить, что значимо большее его содержание выявляется в миометрии. Анализ величины коэффициента параметрической линейной корреляции между количеством серотонина и катехоламинов в ТК эндометрия и миометрия матки демонстрирует увеличение силы связи исследуемых параметров от средней (r=0,60–0,62) в первые сутки после родов до сильной (r=0,74–0,82) к 7-м суткам.

Данные рангового корреляционного анализа демонстрируют высокую силу положительной взаимосвязи изменений в течение послеродового периода практически всех сравниваемых показателей биоаминового статуса ТК. Так, для изменений количества серотонина и катехоламинов в ТК тела матки коэффициент корреляции составляет в эндометрии 0,873, в миометрии – 1,0. Из результатов рангового корреляционного анализа обращает внимание также положительная взаимосвязь изменений содержания гистамина и серотонина в ТК эндометрия тела (ρ=0,800), гистамина и катехоламинов (ρ=0,864). В ТК миометрия этот показатель выше – 0,955. Отрицательная высокая взаимосвязь характеризует изменения содержания моноаминов в ТК и плотности пространственного распределения тканевых базофилов (ρ=–0,600–0,982).

Таким образом, в процессе послеродовой инволюции происходит восстановление высокого уровня корреляционных связей содержания серотонина и катехоламинов в биоаминпозитивных элементах матки, отражая общую закономерность о равновесии процессов анаболизма-катаболизма в рамках гомеостаза клеток, тканей и органов [7-8]. Указанные моноамины являются антагонистами по многим аспектам своего биологического действия, поэтому их количество в нормально функционирующей матке должно быть сбалансировано. Оптимальное соотношение содержания биогенных аминов в микроокружении рабочих клеток создает в нем баланс обменных процессов, регенерационной и функциональной активности, влияет на адаптационные процессы [7].

Высокая насыщенность ТК эндометрия и миометрия биоаминами в первые сутки инволюции матки может быть связана с их повышенной активностью во время родов, когда они активно секретируют серотонин, гистамин, простагландины и другие биологически активные вещества [8]. Окситоцин замедляет поглощение серотонина ТК [13]. Возможно, он оказывает аналогичный эффект и на гистамин. Тканевые базофилы участвуют в обеспечении катехоламинами и серотонином структур миометрия [7]. Для гладких миоцитов этой оболочки матки они, видимо, являются основным поставщиком гистамина.

«После родов программируемый не некротический и не воспалительный процесс ремоделирования соединительной ткани матки приводит к быстрому расщеплению коллагена» (цит. по [8], c. 329), продукция которого в период беременности возрастает многократно. Этот возврат к нормальной структуре органа инициируется интерстициальной коллагеназой. Показана способность гладких миоцитов матки продуцировать этот фермент при стимуляции этого процесса серотонином [11]. Возможно, что с этим связано установленное нами выраженное уменьшение уровня серотонина в тканевых базофилах миометрия в первые сутки после родов, а также значительное увеличение плотности ТК в течение послеродового периода. Отмечается участие ТК в изменении цитоархитектоники эндометрия, ремоделировании кровеносных сосудов [13, 17-18], способность ТК выделять коллагеназу [8]. Это в совокупности с вышеуказанным определяет увеличение после родов плотности данных клеток в матке.

Значительное увеличение плотности тканевых базофилов в ранний послеродовый период может быть связано с отсутствием в первые сутки после родов флуоресцирующих нервных волокон. Установлено, что при денервации участков внутренних органов в них происходит увеличение числа ТК, компенсирующих, очевидно, утрату нервного влияния [19].

Возможно, что тканевые базофилы способствуют восстановлению симпатической иннервации матки в послеродовый период. Установлено, что многие цитокины и медиаторы, продуцируемые ТК, влияют на рост и дифференцировку нервных клеток [20]. Особое место во взаимодействии между ТК и нервными клетками занимают фактор роста нервных клеток (NGF) и гистамин, которые проявляют выраженную биологическую активность в отношении обоих типов клеток.

К 7-му дню структура популяции гладких миоцитов рогов близка к параметрам дородовой матки, что свидетельствует о завершении в ней инволюционных преобразований [4]. Интерес вызывает установленный нами факт, что к 7-м суткам после родов усиливается в миометрии дегрануляция ТК, повышается уровень в них гистамина и с этого дня значительно увеличивается плотность нервных волокон, как свободных, так и в составе периваскулярных сплетений. Значительное уменьшение уровня серотонина в ТК эндометрия и миометрия сразу после родов может быть связано с его участием в гемостазе путем вазоконстрикции маточных сосудов, в процессах послеродовой реконструкции тканей в ходе послеродовой инволюции матки [21].

Заключение. Таким образом, ТК в матке являются основным источником ги- стамина и дополнительным продуцентом серотонина и катехоламинов. Они также поглощают, накапливают и инактивируют излишки моноаминов, которые не были утилизированы рабочими клетками. Это объясняет характерные топографические кооперации тканевых базофилов и симпатических нервных волокон, а также кровеносных капилляров. Нельзя исключать и возможности выполнения ТК в ряде случаев функции переносчиков биоаминов между различными оболочками матки [7]. Можно предположить, ведущую роль ТК в паракринной регуляции гистофизиологи-ческих процессов, происходящих в матке в ходе ее послеродовой инволюции, особенно на ранних этапах. Возможно, что тканевые базофилы способствуют восстановлению симпатической иннервации матки в послеродовый период.