Флуоресцентный анализ белков плазмы крови и эритроцитов молоди пестрого толстолобика (Aristichtus nobilis Richardson) в условиях сочетанного воздействия ионов некоторых тяжелых металлов

Цель исследований: изучение хронозави-симого комплексного воздействия ионов кадмия, свинца и марганца на спектральные характеристики собственной флуоресценции белков плазмы крови и эритроцитов молоди пестрого толстолобика.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на кафедре анатомии, физиологии, гистологии и лаборатории молекулярной биологии кафедры биохимии и биофизики Дагестанского государственного университета. Экспериментальные исследования проводились в весеннее время (апрель-май) 2013 г. Объектом исследования служили годовики пестрого толстолобика ( Aristichtus nobilis Richardson ), выращенные в прудах Широ-кольского рыбокомбината Тарумовского района Республики Дагестан. Рыбы отлавливались и переносились в аквариумы с содержанием ацетата свинца (1,0 мг/л) (ПДК – 0,1 мг/л), хлорида кадмия (0,05 мг/л) (ПДК – 0,005 мл/л) и сульфата марганца (0,1 мг/л) (ПДК – 0,01 мг/л)) [4]. Длительность экспозиции составляла, 5, 15 и 30 суток. Контролем служили рыбы, которые выдерживались в чистой воде Плазму и эритроциты получали по методу Доджа и сотр. [11]. Спектральные измерения белков плазмы крови и эритроцитов проводили на спектрофлуориметре Флюорат-02 Панорама. Обработку спектров производили в программе Origin 9.

Результаты исследований и их обсуждение. Результаты исследований представлены на графиках 1-4, отражающих интенсивность общей (при λвозб=280 нм) и триптофановой (λвозб=295 нм) флуоресценции в диапазоне эмиссии от 290 до 450 нм. Спектральная характеристика флуоресценции плазмы крови зависит от белковых компонентов, входящих в ее состав. Флуоресценция белков обусловлена ароматическими аминокислотами (триптофан, фенилаланин, тирозин), обладающими системой сопряженных двойных связей. Основным флуоресцирующим компонентом является триптофан, который определяет около 90% всей белковой флуоресценции [12]. Спектры флуоресценции белков плазмы и эритроцитов крови пестрого толстолобика в норме представлены на рис. 1.

Рис. 1. Интенсивность флуоресценции белков плазмы крови (л _И1зб. -280 и 295 нм) и мембранных белков эритроцитов (л возб. -280) годовиков пестрого толстолобика в контроле

Рис. 2. Интенсивность флуоресценции белков плазмы крови (л_{т з}б. -280 и 295 нм) и мембранных белков эритроцитов (Х в_озб. -280) годовиков пестрого толстолобика при сочетанном влиянии ионов Cd²⁺, Pb²⁺ и Mn²⁺ в течение 5 суток

Расположение максимумов собственной флуоресценции белков плазмы (λвозб=280 нм) и (λвозб=295 нм) характеризуется близкими значениями спектральных характеристик и имеет достаточно длинноволновое положение. Аналогичная независимость положения максимума спектра флуоресценции отмечается и для нативных мембран эритроцитов. Это указывает на то, что собственная флуоресценция белков плазмы обусловлена преимущественно триптофановыми остатками, частично доступными водному окружению. В отличие от белков плазмы крови, максимум интенсивности суммарной флуоресценции мембранных белков эритроцитов имеют коротковолновое положение (315-320 нм), что указывает на гидрофобное окружение триптофанилов [6, 7]. Через 5 суток экспозиции рыб в среде ТМ (рис. 2) интенсивность общей флуоресценции возрастает и достигает 15,5 единиц (против 11,5 в контроле). Возрастание интенсивности очевидно связано с адаптивными перестройками белковых компонентов плазмы и увеличением глобулиновой фракции белков, богатой ароматическими аминокислотами. На фоне увеличения общей флуоресценции белков плазмы крови выявлена тенденция к снижению интенсивности триптофановой флуоресценции. Тот факт, что интенсивность флуоресценции мембранных белков эритроцитов и их спектральная характеристика не изменяются, свидетельствует об относительной целостности эритроцитарных мембран.

На 15 сутки экспозиции (рис. 3) интенсивность общей и триптофановой флуоресценции белков снижается относительно показателей предыдущего срока экспозиции. При этом наблюдается незначительный сдвиг максимума общей флуоресценции в длинноволновую область, что характерно для полярного окружения белковых молекул в результате их модификации.

Рис. 3. Интенсивность флуоресценции белков плазмы крови (Х вузб. -280 и 295 нм) и мембранных белков эритроцитов (Х вузб. -280) годовиков пестрого толстолобика при сочетанном влиянии ионов Cd²⁺, Pb²⁺ и Mn²⁺ в течение 15 суток

Рис. 4. Интенсивность флуоресценции белков плазмы крови (Х вузб. -280 и 295 нм) и мембранных белков эритроцитов (Х вузб. -280) годовиков пестрого толстолобика при сочетанном влиянии ионов Cd²⁺, Pb²⁺ и Mn²⁺ в течение 30 суток

После длительной 30 дневной экспозиции в среде тяжелых металлов (рис. 4) вновь возрастает интенсивность общей и триптофановой флуоресценции белков плазмы крови. Между тем флуоресценция мембранных белков эритроцитов ниже по сравнению с контролем, что указывает на значительную модификацию белковых компонентов эритроцитарных мембран.

Выводы: фазные изменения интенсивности флуоресценции отражают, главным образом, количественные адаптивные перестройки белков плазмы крови. При этом не исключено, что ионы марганца, обладающие супероксидустраняющей активностью, на начальных этапах экспозиции рыб способны сдерживать развитие окислительного стресса и накопление продуктов свободнорадикального окисления. Однако более продолжительное воздействие комплекса ТМ на организм рыб вызывает изменение флуоресценции мембранных белков эритроцитов, что указывает на их деструктивную модификацию и значительную уязвимость кроветворной системы рыб, что может быть использовано в качестве индикатора повреждающего воздействия.

Работа выполнена при поддержке госзадания Минобрнауки России в сфере научной деятельности.