Формирование и функционирование микробных матов минерального источника Хойто-Гол (Восточный Саян)

формирования и функционирования матов [7]. Формирование микробных матов определяется многими факторами, такими, как температура, рН, освещение, содержание сероводорода, химический состав воды; расстояние от выхода источника также может влиять на сукцессию микроорганизмов [2, 8].

Сульфидные термальные источники с нейтральными или щелочными значениями рН относительно редко встречаются [2]. Бактерии, которые в них развиваются, часто образуют маты или длинные нити, которые могут быть белого или ярко-желтого цвета из-за осажденной серы. В этих источниках важнейшим абиотическим фактором, влияющим на формирование микробного сообщества, является сероводород. К такому типу источников относится мезотермальный источник Хойто-Гол, расположенный в горной системе Восточного Саяна. Особенности формирования микробных матов и оценка активности физиологических групп микроорганизмов в матах этого источника изучены недостаточно полно. Ранее были исследовано влияние экологических условий на распределение микроорганизмов и роль микроорганизмов в травер-тинобразовании [9-11].

Цель исследования :– изучение особенностей формирования и функционирования микробных матов сульфид-содержащего источника Хойто-Гол.

Материалы и методики исследования. Минеральный источник Хойто-Гол имеет 5 выходов воды, расположенных вниз по течению реки Аршан (приток реки Хойто-Гол) на высоте 1712 м над уровнем моря

(52.37.255 N, 099.00.875 E). Пробы воды и микробных матов отбирали летом 2013 г. Определение физикохимических характеристик воды проводили с помощью портативных приборов и стандартных методов гидрохимии [12]. Скорости микробных процессов определяли радиоизотопным методом [13]. Учет численности зеленых нитчатых бактерий, зеленых и пурпурных серобактерий, пурпурных несерных бактерий, тионовых, целлюлозоразлагающих, амилолитических, протеолитических, сульфатредуцирующих бактерий проводили методом предельных разведений на селективных питательных средах [14]. Морфологию клеток, размеры и подвижность изучали микроскопированием с помощью световых микроскопов Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия) и Olympus BX 41 (Olympus, Япония). Исследование поверхности и элементного состава микробных матов и пленок, образовавшихся при культивировании тионовых бактерий, проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа SEM TM-1000 (HITACHI, Япония). Определение таксономической принадлежности цианобактерий проводили на основании морфологических признаков по определителям [15, 16]. Пигментный состав фототрофных бактерий определяли по положению максимумов на спектрах поглощения пигментов, полученных на спектрофотометре СФ-56 (ЛОМО, Россия).

ДНК клеток монокультур аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий выделяли с помощью ЦТАБ-метода с незначительными изменениями [17].

ДНК клеток всех остальных культур бактерий выделяли с помощью метода, описанного ранее Булыгиной с соавторами [18]. Молекулярно-генетическую идентификацию монокультур аноксигенных фототрофных бактерий и чистых культур сероокисляющих и суль-фатредуцирующих бактерий проводили посредством анализа последовательностей генов 16S рРНК и fmoA (Fenna–Matthews–Olson protein) в Центре «Биоинженерия» РАН (г. Москва). Сравнительный анализ нуклеотидных данных с последовательностями базы данных GenBank проводили с помощью программных пакетов BLAST .

Результаты исследования и их обсуждение.

Характеристика минерального источника Хойто-Гол. В период исследования температура воды в местах отбора проб составляла 32,5-34,0°С, рН воды был нейтральным (табл. 1). Тип воды источников – гидрокарбонатно-натриевый. Содержание гидрокар-бонат-ионов составляло более 400 мг/дм³, содержание СО 2 достигало 57,0 мг/дм³. Содержание ионов Na⁺ составляло 143-149 мг/дм³. Низкий окислительновосстановительный потенциал (от -23 до -130 мВ) обусловлен, скорее всего, наличием сероводорода, поступающего с вулканическими эксгаляциями, а также из донных осадков в процессе сульфатредукции. Содержание сероводорода колебалось от 0,52 до 7,05 мг/дм³. По литературным данным, содержание сульфида может достигать 20 мг/л [9]. Концентрация ионов SO 4 ^2-достигала 33 мг/дм³, а Сl^- – 24 мг/дм³.

Таблица 1. Физико-химические и микробиологические показатели источника Хойто-Гол

Станция	Описание микробных матов	T, °C	рН	H 2 S, мг/л	Видовой состав матообразующих форм бактерий
Hg1 верхний выход источника	тонкая зеленая биопленка толщиной 1 мм	34,0	7,32	6,69	цианобактерии Phormidium sp., Anaba-ena sp., Microcystis sp.
Hg2 новый выход	темно-зеленый мат толщиной 5 мм	33,6	7,33	7,03	цианобактерии Phormidium sp., Ana-baena sp., Microcystis sp.
далее по ручью: Hg2-1 в 3 м от ст. Hg2	зеленый мат с белыми и рыжими обрастаниями толщиной до 2 см	33,4	7,45	7,05	цианобактерии Phormidium sp., Ana-baena sp., Oscillatoria sp., Synechococcus sp., Gloeocapsa magma , бесцветные серобактерии Thiothrix sp.
Hg2-2 в 5 м от ст. Hg2	серный мат с зелеными вкраплениями толщиной 1 см	32,6	7,84	7,28	цианобактерии Phormidium sp., Oscilla-toria sp., Gloeocapsa magma , Synechococ-cus sp., бесцветные серобактерии Thiothrix sp.
Hg2-3 ручей после ванного комплекса №1	зеленый мат с белыми обрастаниями толщиной 1 см	32,5	7,65	7,17	цианобактерии Phormidium sp., Oscilla-toria sp., Gloeocapsa magma , Sy-nechococcus sp., бесцветные серобактерии Thiothrix sp.
Hg2-4 ручей после ванного комплекса №2	светло-зеленый мат толщиной 7 мм	32,7	7,35	7,03	цианобактерии Phormidium sp., Ana-baena sp., Oscillatoria sp., Gloeocapsa magma , Microcystis sp.
Hg3 новый выход «Питьевой источник»	тонкая зеленая биопленка толщиной 2 мм	33,5	7,32	0,52	цианобактерии Phormidium sp., Anaba-ena sp., Microcystis sp.

Описание микробных матов. В зоне выходов и вниз по ручью исследуемого источника развивались микробные маты толщиной до 2 см, которые были представлены зоной оксигенного фотосинтеза с преобладающим развитием зеленых скоплений цианобактерий и зоной развития серных бактерий (табл. 1). На верхнем выходе Hg1 и выходе питьевого источника Hg3 развивались тонкие микробные маты зеленого цвета толщиной 1-2 мм, на выходе Hg2 микробный мат был толще – до 5 мм. Основу матов на выходах источников составляли цианобактерии Phormidium sp., Ana-baena sp., Microcystis sp. Спектры поглощения пигментов из микробных матов подтверждают преобладание цианобактерий, для которых характерно наличие хлорофилла α с максимумом при 675 нм (рис. 1-1).

По изливу минерального ручья на станциях Hg2-1, Hg2-2, Hg2-3 и Hg2-4 наблюдались микробные маты толщиной до 2 см, состоящие в основном из нитчатых цианобактерий и бесцветных серобактерий Thiothrix sp. Видовой состав цианобактерий увеличивается за счет появления Oscillatoria sp., Gloeocapsa magma и Synechococcus sp. Спектры поглощения пигментов из микробных матов показывают наличие цианобактерий с хлорофиллом α (максимум поглощения при 674 нм) и аноксигенных фототрофных бактерий, содержащих ответственные за поглощение света бактериохлорофиллы (рис. 1-2). Максимум инфракрасного поглощения в клетке при 745 нм характерен для бактериохлорофилла с , имеющегося у всех зеленых серобактерий класса Chlorobi и у некоторых нитчатых аноксигенных фототрофов класса Chloroflexia . Пики 805 нм и 875 нм на спектрах поглощения пигментов в клетке указывают на присутствие бактериохлорофилла а , преобладающего у большинства пурпурных фототрофных бактерий, у всех зеленых серобактерий и нитчатых аноксигенных фототрофных бактерий.

Рис. 1. Спектр поглощения микробного мата: 1 – со станции Hg2; 2 – со станции Hg2-1

Появлению в составе микробного мата бесцветных серобактерий Thiothrix sp. способствовало развитие мата в условиях проточной воды, что необходимо для создания градиента сероводорода и кислорода [19, с. 166-171]. На поверхности микробного мата формируются белые минеральные отложения. Результаты исследования элементного состава показали, что они состоят из элементной серы, содержание которой достигает 99% (рис. 2). Бесцветные серобактерии участвуют в аккумуляции и кристаллизации серы и играют важную роль в поведении системы в целом, так как в ночное время окисление соединений серы оказывается основной статьей расхода кислорода [20].

Рис. 2. Минеральные отложения: 1 – формирующиеся на поверхности микробного мата со станции Hg2-1;

2 – формирующихся на поверхности микробного мата

Интенсивность продукции и деструкции органического вещества в микробных матах. Скорость фотосинтеза в микробных матах была равна 0,17-7,61 мг С/(дм3∙сут) (табл. 2). Значительный вклад в осуществление процесса вносят аноксигенные фототрофы – скорость аноксигенного фотосинтеза составила 0,09-4,8 мгС/(дм3∙сут). Хемосинтез в микробных матах протекал со скоростью 0,05-1,43 мгС/(дм3∙сут), а гетеротрофная ассимиляция СО2 варьировала от 0,05 до 0,78 мгС/(дм3∙сут). Значения продукционных процессов исследуемого источника были ниже, чем в более высокотемпературных гидротермах [21, 22]. Были определены скорости сульфатредукции и метаногенеза, завершающие процесс анаэробной деструкции органического вещества. Скорость сульфатредукции в микробных матах исследуемого источника составила 0,04-0,93 мгS/(дм3∙сут) при расходе углерода на этот процесс 0,04-0,70 мгC/(дм3∙сут). В зеленых матах с преимущественным развитием цианобактерий, расход органического вещества на сульфатредукцию и метаногенез были примерно одинаковым. В мате с белыми обрастаниями, где происходит появление серобактерий, скорость сульфатредукции намного превышала интенсивность метаногенеза. Образование первичными анаэробами низкомолекулярных органических веществ, присутствие сульфатов способствуют активной деятельности сульфатредуцирующих бактерий.

Таблица 2. Скорость процессов продукции и деструкции в микробных матах источника Хойто-Гол

Процессы	Hg1	Hg2	Hg 2-1	Hg2-2	Hg2-3
общий фотосинтез, мгС/(дм3∙сут)	2,36	7,61	6,03	0,17	5,99
аноксигенный фотосинтез, мгС/(дм3∙сут)	1,71	3,4	3,2	0,09	0,58
хемосинтез, мгС/(дм3∙сут)	0,24	1,43	1,16	0,03	0,62
гетеротрофная ассимиляция СО 2 , мгС/(дм3∙сут)	0,26	0,19	0,37	0,02	0,78
сульфатредукция, мгS/(дм3∙cут)	0,04	0,28	0,42	0,93	0,27
расход С при сульфатредукции, мгС/(дм3∙cут)	0,03	0,21	0,32	0,70	0,25
метаногенез, мгС/(дм3∙сут)	0,02	0,06	0,001	-	-
расход С при метаногенезе, мгС/(дм3∙cут)	0,10	0,23	0,005	-	-

Количественный учет различных физиологических групп микроорганизмов. Численность аноксигенных фототрофных бактерий, вклад которых в процесс фотосинтеза составляет около 50%, достигала 10⁴-10⁵ кл/см³. Кроме фототрофных бактерий, в продукции органического вещества в микробных матах участвуют также сероокисляющие бактерии, ассимилируя углекислый газ и используя энергию окисления сероводорода. Количество сероокисляющих бактерий варьировало в пределах 10⁴-10⁶ кл/см³. На начальных этапах деструкции главную роль играют бактерии-гидролитики, разлагающие полимерные соединения [23, с. 143-157]. Доминирующими были протеолитические бактерии, их численность достигала 10⁸ кл/см³ в толстом продуктивном мате.

Рис. 3. 1 – морфология нитчатой аноксигенной фото-трофной бактерии Oscillochloris trichoides, изолированной из микробного мата Hg2; 2 – спектр поглощения клеток культуры Oscillochloris trichoides

Количество бактерий, разлагающих крахмал, варьировало от 105 до 107 кл/см3. Максимальная численность целлюлозоразлагающих бактерий достигала 107 кл/см3.Активная роль на конечных этапах деструкции органического вещества в микробных матах принадлежит сульфатредуцирующим бактериям, численность которых составляла 104–106 кл/см3 при использовании лактата натрия в качестве источника углерода и энергии.

Выделение и идентификация культур аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий. Из микробных матов Hg2, Hg2-3 были выделены 2 монокультуры аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий. На среде, содержащей сульфид, они образовывали колонии светло-зеленого цвета диаметром до 2 мм. Полученные культуры представляли собой тонкие нити с газовыми вакуолями толщиной до 5 мкм (рис. 31). В качестве основного пигмента бактерии содержали бактериохлорофилл с с максимумом поглощения в клетках при 746 нм (рис. 3-2). Филогенетический анализ, основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, показал, что штаммы относятся к виду Oscillochloris trichoides (99% сходства).

Зеленые серобактерии. Были получены 3 культуры зеленых серобактерий, которые участвуют в окислении сульфида при фотосинтезе, с образованием элементной серы вне клеток. При росте на агаре они образовывали колонии темно-зеленого цвета, диаметром 1-2 мм. Морфологически бактерии представляли собой палочковидные клетки, формируя короткие ветвящиеся цепочки, и соответствовали видам рода Chlorobium (рис. 4-1). Основным пигментом у них был бактериохлорофилл с (максимум поглощения 742 нм) (рис. 4-2). При сравнении аминокислотной последовательности ФМО-протеина ( fmo A), полученной при трансляции in silico фрагмента гена fmo A, амплифицированно-го из выделенной нами культуры, с референтными последовательностями, было определено, что она наиболее близка к виду Chlorobium limicola.

Несерные пурпурные бактерии присутствовали в микробных матах во всех исследованных станциях. Было выделено 7 чистых культур несерных пурпурных бактерий, морфологически соответствующих родам Rhodobacter, Rhodopseudomonas и Rhodomicrobium. Несерные пурпурные бактерии рода Rhodobacter sp. морфологически были представлены короткими овальными палочками. В анаэробной среде образовывали колонии темно-коричневого цвета, а в аэробной среде бордового цвета. Бактерии рода Rhodomicrobium sp. представляли собой короткие овальные палочки, размножающиеся почкованием с образованием гифоподобных тонких нитей, что характерно для известного вида Rhodomicrobium vannielii. Данные филогенетического анализа подтвердили, что бактерия относится к виду Rhodomicrobium vannielii (99% сходства). Два остальных морфотипа выделенных несерных пурпурных бактерий филогенетически были близки к видам Rhodopseudomonas palustris и Rhodopseudomonas faecalis. Подвижные палочковидные бактерии, размножаются почкованием. В старых культурах образуют розеткоподобные кластеры.

Рис. 4. 1 – морфология зеленой серобактерии Chlorobium limicola, выделенной из микробного мата станции Hg2-3; 2 – спектр поглощения клеток культуры Chlorobium limicola

Тионовые бактерии. Были получены 4 чистые культуры тионовых бактерий, которые были представлены подвижными одиночными и парными палочками длиной до 1,5 мкм. На основании данных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК культуры соответствовали виду Thiobacillus thioparus, идентичность с которым составила 99%. При культивировании среда мутнела на 3-5 сутки, и на ее поверхности появлялась белая пленка. Результаты исследования элементного состава пленки показали, что она состоит из элементной серы, содержание которой достигает 100%.

Сульфатредуцирующие бактерии. Из микробных матов было выделено 2 чистые культуры суль-фатредуцирующих бактерий, которые представлены грамотрицательными вибрионами, подвижными за счет одного полярно расположенного жгутика. Филогенетический анализ, основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, показал, что штаммы близки между собой и относятся к виду Desulfovibrio alcoholivorans (99% сходства).

Выводы: м инеральный источник Хойто-Гол относится к гидрокарбонатно-натриевому типу с наличием сероводорода. Экологические условия среды обитания микробных сообществ в исследуемом источнике являются благоприятными для развития и функционирования бактерий, участвующих в продукции и деструкции органического вещества. В микробных матах источника основными формообразующими бактериями являются цианобактерии Phormidium sp. и бесцветные серобактерии Thiothrix sp. В продукции органического вещества участвуют фототрофные бактерии, бесцветные серобактерии и тионовые бактерии. Отличительной особенностью микробных матов источника Хойто-Гол являлось доминирование и разнообразие бактерий цикла серы. Важная роль бактерий серного цикла в источнике Хойто-Гол подтверждается высокими численностями сульфатредуцирующих и тионовых бактерий, интенсивностями процессов сульфатредук-ции и аноксигенного фотосинтеза. Выделены чистые культуры пурпурных несерных бактерий ( Rhodopseu-domonas palustris , Rhodobacter capsulatus , Rhodomicrobium vannielii ), нитчатых аноксигенных бактерий ( Oscillochlo-ris trichoides ), зеленых серобактерий ( Chlorobium limicola), тионовых бактерий (Thiobacillus thioparus), сульфатредуцирующих бактерий (Desulfovibrio alcoholivorans) и показано их участие в цикле серы в микробных матах. Выделенные штаммы бактерий могут быть использованы в биотехнологии, в частности в процессах биоремедиации загрязненных территорий.

Работа выполнена в рамках бюджетного проекта VI.55.1.2. «Филогенетическое разнообразие и экологическая роль прокариот в экстремальных природных экосистемах». Отдельные этапы работы выполнены при финансовой поддержке грантов Министерства образования и науки РФ № 1990, РФФИ 15-04-01275-а, 15-44-04335-р_сибирь_a.