Формы гибели клеток и мишени при фотодинамической терапии

Фотодинамическая терапия – метод лечения рака, включающий системное введение фотосенсибилизатора, который в некоторой степени накапливается в опухолевой ткани. По прошествии определенного времени опухоль облучается с помощью наружного облучения либо с помощью интерстициальных оптических волокон. ФС возбуждается светом с образованием долгоживущего триплетного состояния, которое может реагировать с окружающим кислородом с образованием активных форм кислорода, таких как синглетный кислород и/или гидроксильные радикалы, которые убивают опухолевые клетки, разрушают кровеносные сосуды опухоли и приводят к регрессу и некрозу опухоли [1].

К настоящему времени накоплен большой объем информации, свидетельствующий об эф- фективности этого вида терапии [2]. Совершенствованию метода способствует создание новых источников света, которые могут обеспечить широкое использование и клиническое признание фотомедицинских стратегий, включая ФДТ и фотобиомодуляцию [3]. Сочетание этих фотомедицин-ских технологий обеспечит дальнейший прогресс в лечении онкологических заболеваний [4]. Повышению уверенности в завтрашнем дне ФДТ придают результаты исследований при терапии опухолей, плохо реагирующих на лечение, например рака поджелудочной железы и мезотелиомы [5].

Тем не менее применение ФДТ в значительной мере тормозится недостаточным уровнем знаний о механизмах необратимого повреждения опухолевых клеток [6]. ФДТ способна стать инструментом для изучения путей, ведущих к гибели клеток. При этом субклеточные мишени при ФДТ во многом определяются свойствами ФС, способных преимущественно сенсибилизировать злокачественные клетки к световому воздействию.

В начале 60-х гг. прошлого столетия Липсон и соавт. обнаружили фотосенсибилизирующий эффект с использованием производного гематопорфирина – HpD, хотя данный ФС и не отличался химической чистотой. Его структура состояла из набора мономерных и олигомерных простых и сложных эфиров порфиринов [7]. В 1978 г. Догерти с соавт. очистили HpD, произвели фотофрин и показали, что энергия фотодинамического процесса с использованием фотофрина примерно в 100 раз выше, чем энергия, необходимая ионизирующему излучению для достижения того же уровня уничтожения новообразования. Фотофрин стал первым клинически одобренным ФС для лечения рака. Началась современная эра применения ФДТ [8].

Сегодня фотофрин по-прежнему является наиболее широко используемым ФС во всем мире. Однако он имеет много недостатков, в том числе длительный период полураспада, который длится от недель до месяцев, что приводит к длительной повышенной светочувствительности кожи, и небольшой пик поглощения в области 630 нм, затрудняющий проникновение излучения в объемные опухоли. С тех пор было разработано несколько сотен ФС для повышения эффективности ФДТ в борьбе с раком и многими другими заболеваниями и инфекциями [9].

По сравнению с фотофрином большинство ФС второго поколения представляют собой чистые одиночные соединения и имеют высокие квантовые выходы синглетного кислорода. Они возбуждаются на более длинных волнах, что обеспечивает более глубокое проникновение света в ткани и может использоваться для лечения глубоко расположенных опухолей, что приводит к повышению эффективности лечения [10].

До недавнего времени считалось, что гибель клеток при проведении ФДТ является результатом одного из трех различных процессов: некроза, апоптоза или аутофагии [11]. Количественно смоделирован эффект гибели клеток при ФДТ [12]. При этом апоптоз – первый тип программируемой гибели клеток – считается одной из основных форм элиминации опухолевых клеток, опосредуемых ФДТ. Основной механизм апоптоза клеток, индуцированного ФДТ, тесно связан с содержанием активных форм кислорода. В результате активирования ФС лазерным излучением генерируется большое количество активных форм кислорода, повреждающих клеточные структуры, в том числе ДНК [13], с минимальным воздействием на окружающие ткани. Пути сигнальной трансдукции от поврежденной ДНК до запуска гибели клеток путем апоптоза хорошо изучены [14].

Длительное время некроз рассматривался как неконтролируемая форма клеточной гибели, морфологическими признаками которой являлись набухание и гомогенизация цитоплазмы с деструкцией органелл на фоне стохастической деградации ДНК, неспецифической компактизации хроматина и последующего разрыва клеточных мембран с выходом содержимого клеток во внеклеточное пространство и развитием воспалительной реакции. Причиной гибели при некрозе считают «энергетическую катастрофу» – падение содержания АТФ в клетках до уровня, не совместимого с жизнью [15].

Понятие некроптоз («necroptosis», программированный некроз) – третий тип генетически регулируемой гибели клеток – сформировалось около 20 лет назад на основании данных о том, что существует сигнальный путь инициации некроза в ответ на связывание рецепторами молекул суперсемейства фактора некроза опухолей на фоне подавления апоптоза [16]. Сигнальные пути при некроптозе подробно изложены в обзоре [17].

Клетки, подвергающиеся аутофагии – второму типу программированной клеточной гибели, – используют аутофагический/лизосомальный компартмент для деградации и утилизации поврежденных клеточных органелл и макромолекул путем самопереваривания. Морфологически этот процесс характеризуется образованием в цитоплазме многочисленных аутофагосом – вакуолей, ограниченных двойной мембраной [18].

Учитывая вышеизложенное, становится очевидным, что понимание путей клеточной гибели и взаимосвязи между ними крайне важно для разработки новых эффективных методов лечения рака, включая ФДТ. Так, недавно стало ясно, что существует ряд подтипов апоптоза и что между апоптозом, некрозом и аутофагией существует некоторое совпадение [19].

В настоящее время есть понимание того, что эрадикация опухоли может быть усилена, если ФДТ включать в «комбинированные» протоколы. При использовании химиотерапии или комбинации ФС появляется возможность сохранения их эффективности при применении пониженных дозировок лекарственного препарата. Начало апоптотической гибели после ФДТ в конечном результате приводит к значительному повышению результативности лечения, что способно компенсировать неоптимальную доставку света и кислорода в опухоль [20]. Кроме того, ФДТ в комбинации с лучевой терапией может значительно повысить чувствительности опухоли к лучевой терапии, тем самым улучшить качество жизни. С помощью противоопухолевых иммунных агентов ФДТ может успешно применяться для лечения резистентных новообразований, метастазов и предотвращения рецидивов опухоли [21].

Способность ФС воздействовать на определенные субклеточные мишени позволяет на новом уровне изучать пути гибели клеток. Фотосенсибилизирующие агенты могут инициировать повреждение самых различных клеточных структур, прежде всего это касается митохондрий, лизосом и плазматических мембран. Поэтому характеристика новых ФС часто включает информацию об участках субклеточной локализации этих фотосенсибилизирующих агентов. Недавние исследования показали, что особенно эффективной мишенью ФС при проведении ФДТ являются лизосомы и митохондрии [20]. Видимо, этим объясняется эффективность упомянутого выше фотофрина, имеющего относительно слабую полосу поглощения в области 630 нм, поскольку субклеточные мишени находятся в пределах диапазона действия этого ФС [22].

Излучение с длиной волны 630 нм имеет довольно ограниченную глубину проникновения. Поэтому очень актуальной становится разработка нового ФС, имеющего субклеточные мишени фотофрина, но с полосой поглощения в ближнем ИК-диапазоне. Такой ФС может быть идеальным для ФДТ. Пока ученые находятся в поиске такого препарата, хорошую эффективность показывают и ФС II класса. Продемонстрирована результативность ФДТ с использованием российского ФС фотодитазина (производного хлорина е6). Раскрыты механизмы действия и установлены основные тканевые и клеточные мишени этого ФС, включающие эндотелий кровеносных сосудов и плазматическую мембрану опухолевых клеток. Внутриклеточными мишенями являются также внутренние клеточные структуры и механизмы, отвечающие за пролиферацию и биосинтез [23].

Основной формой клеточной гибели после ФДТ с использованием фотодитазина является прямой фотокоагуляционный некроз, который обусловлен деструкцией фотосенсибилизированных структур клетки. В результате альтерации сосудов новообразования развивается и ишемический некроз. Уровень индуцированного апоптоза при этом не зависит от плотности подведенной световой энергии [24].

Сегодня, разрабатывая новые ФС для проведения ФДТ крупных, глубокозалегающих новообразований, особое внимание уделяют синтезу производных бактериохлорофилла-α, которые имеют интенсивное поглощение света в длинноволновой области. Представлены результаты недавнего применения нового ФС дисульфида-БПИ, показывающие его высокую активность. При этом наблюдались разрушение сосудистого русла и быстрое ингибирование пролиферативной активности опухолевых клеток с последующей их девитализацией в результате запуска апоптоза и некроза. Цитостатический эффект и деструкция микроциркуляторного русла, а также последующее развитие некроза обусловлены, по всей вероятности, прямым воздействием светового излуче- ния на сенсибилизированные дисульфидом-БПИ клеточные элементы паренхимы и стромы новообразования. Снижение пролиферативной активности клеток опухоли, судя по всему, обусловлено непосредственно прямым влиянием продуктов реакций данного ФС на внутриклеточные мишени. При этом также нельзя исключить возможный вклад появляющейся гипоксии, которая быстро развивается в условиях нарушения гемодинамики и повышенного расходования кислорода при ФДТ. Согласно представленным данным, эффективность ФДТ с дисульфидом-БПИ обусловливается последовательностью происходящих в паренхиме опухолей и окружающих тканях изменений, носящих деструктивный и воспалительный характер. Кроме этого, большое значение имеет репопуляционный потенциал клеток опухоли, выживших после ФДТ. Вероятно, если сохраняются выжившие опухолевые клетки, то это происходит из-за неравномерности накопления ФС в эффективной концентрации в некоторых слабо васкуляризированных участках опухоли. Эти результаты свидетельствуют о перспективности использования дисульфид-БПИ для ФДТ злокачественных новообразований и необходимости дальнейших работ в этом направлении [25, 26].

Как показали недавние исследования, еще одна форма гибели клеток – параптоз, который обычно связан с дефектными белками в эндоплазматическом ретикуломе, – может быть более частым результатом ФДТ, чем предполагалось ранее. Несмотря на то, что биохимических тестов на параптоз пока нет, морфологию этого процесса можно определить по появлению множественных цитоплазматических вакуолей [27, 28]. Параптоз, индуцированный ФДТ, может быть путем гибели клеток с нарушенной программой апоптоза [29]. Использование ФДТ для изучения параптоза может служить еще одним примером потенциального применения селективного фотоповреждения для изучения путей смерти клетки.

Апоптоз, аутофагия и параптоз могут возникать после фотоповреждения митохондрий, лизосом или эндоплазматического ретикулума. Баланс этих путей часто является определяющим фактором общей эффективности терапии [30]. Фотоповреждение органелл приведет к контролируемой гибели клеток, а не к мутагенному процессу в ядрах. При этом контролируемая гибель клеток приводит к отсутствию некроза тканей, что создает риск неконтролируемой воспалительной реакции [31].

Заключение

Способность фотосенсибилизирующих агентов создавать фотоповреждения в определенных субклеточных участках оказалась полезной для изучения путей гибели клеток и определения оптимальных мишеней для повышения эффективности противоопухолевой терапии.