Фосфиновая модификация трипептида GPE и моделирование его свойств

Введение. Исследования, проведенные в 1989 году, выявили что Gly-Pro-Glu (GPE) находится в организме как часть инсулиноподобного фактора роста 1 и является новым нейроактивным пептидом с мощным действием на высвобождение ацетилхолина, а также играет роль в регуляции функций мозга [1]. В этих исследованиях было обнаружено, что GPE участвует в различных процессах в центральной нервной системе. GPE был синтезирован и показал, что ингибирует связывание глутамата с рецептором N-метил-D-аспартата (NMDA). Кроме того, GPE имел мощное стимулирующее действие на калий-индуцированное высвобождение ацетилхолина из срезов коры головного мозга крыс [2]. В дальнейшем было множество исследований посвященным нейропротек-торному и ноотропному действию Gly-Pro-Glu [3-9] и на данный момент GPE является одним из перспективных нейропротек- торных агентов. В настоящей работе осуществлялась модификация трипептида GPE путем замены одной пептидной связи C(O)NH в молекуле трипептида негидролизуемым метиленфосфорильным фрагментом P(O)(OH)CH2. Такой подход в последние несколько лет используется в качестве основного ключа для построения фосфиновых кислых изостеров пептидов и является достаточно успешным в плане поиска лекарственных средств противовирусного, противоопухолевого характера, средств против иммунодефицита [10] и ряда других болезней [11-13]. Фосфиновые кислотные псевдо-пептиды, у которых пептидная связь заменена на негидролизуемый метиленфосфорильный фрагмент, являются ингибиторами процессов, происходящих с гидролитическим или ферментативным расщеплением пептидной связи, что позволяет использовать псевдопептиды как соединения-имитаторы, для изучения и, главным образом, возможной регуляции ряда метаболически важных процессов. Эти предпосылки позволяют предполагать достаточно высокую степень сохранения свойств исходной молекулы в молекуле структурного фосфоизостера, что справедливо для какого-либо короткого пептида, свойства которого главным образом определяются конкретной аминокислотной последовательностью. Предлагаемая фосфиновая замена пептидной связи сохраняет исходную аминокислотную последовательность и увеличивает устойчивость псевдо-пептидной связи образовавшегося фосфоизостера к гидролитическому воздействию пептидаз на пути к биомишени, что и позволяет рассчитывать на повышение его эффективности в сравнении с исходной гидролитически лабильной молекулой.

Результаты. На первом этапе работы нами был осуществлен синтез фосфинового аналога дипептида псевдо-пролилглутамата Pro-[P(O)(OH)CH₂]-Glu 1.1 [14] (рис. 1), с соответствующими защитными группами на атоме фосфора и карбоксильных концах, для дальнейшего использование в качестве N-компоненты в пептидном синтезе. Дальнейшая обработка фосфиновой кислоты 1.2 смесью адаман-тилбромида и оксида серебра в хлороформе позволили получить адамантиловый эфир фосфиновой кислоты 1.3 в соответствии с известной методологией защиты гидроксифосфорильной функции. После чего осуществлялось селективное снятие защитной группы с атома азота путем каталитического гидрирования (рис. 1).

Рис. 1. Синтез фосфинового P,С-защищенного пролилглутаматного блока

Далее нами был осуществлен успешный синтез модифицированного «псевдопептида» Gly-Pro-[P(O)(OH)CH2]-Glu (GPE(phos)) 2.1, фосфинового аналога GPE, путем присоединения N-Boc-защищенной аминокислоты глицина к фосфиновому P,С-защищенному пролилг- лутаматному блоку Pro-[P(O)(OH)CH2]-Glu 1.1, в соответствии с известными методиками пептидного синтеза (рис. 2). Препаративная очистка и анализ осуществлялись при помощи методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

Рис. 2. Схема синтеза фосфинового «псевдо-пептида» Gly-Pro-[P(O)(OH)CH 2 ]-Glu

Прогноз биологических активностей исходного трипептида GPE (табл. 1) и его фосфинового аналога GPE(phos) (табл. 2) осуществлялся программой PASS (“Prediction of Activity Spectra for Substances”), разработанная в Институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. Она содержит более 250000 веществ с известной биологи- ческой активностью, включает более 3500 фармакологических эффектов и механизмов действия. Результаты прогноза биологической активности представлены в виде спектра биологической активности, включающих список активностей и вероятностей: Ра - «быть активным», Рi - «быть неактивным».

Таблица 1. Пр                                сходного трипептида GPE програм мой “Prediction of

NH

O

O

O

HN

OH

OH

0,905	0,004	e inhibitor
0,898	0,004	or
,	,	X-Pro dipeptidase inhibitor
0,837	0,014	Methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH) inhibitor
0,835	0,002	Saccharolysin inhibitor
0,819	0,005	Analeptic
0,815	0,004	Antihypoxic
0,804	0,032	Phobic disorders treatment
0,800	0,009	Protein-disulfide reductase (glutathione) inhibitor
0,774	0,004	Pyroglutamyl-peptidase II inhibitor
0,763	0,020	Glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase inhibitor
0,756	0,007	Limulus clotting factor C inhibitor
0,752	0,007	Methylamine-glutamate N-methyltransferase inhibitor
0,728	0,003	Meprin A inhibitor
0,727	0,022	Acylcarnitine hydrolase inhibitor
0,721	0,004	Acrosin inhibitor
0,712	0,003	Catalase inhibitor
0,699	0,015	Dimethylargininase inhibitor
0,698	0,023	Fibrinolytic
0,682	0,010	Pyroglutamyl-peptidase I inhibitor
0,659	0,003	Bontoxilysin inhibitor
0,649	0,011	Renal tissue kallikrein inhibitor
0,649	0,005	Tripeptidyl-peptidase I inhibitor
0,646	0,057	Nootropic

Таблица 2. Про                         стей фосфинового аналога GPE(phos) программой “Predictio                           ances”

0,851	0,010	ehyde dehydrogenase inhibitor
0,734	0,005	Stroke treatment
0,711	0,014	Immunostimulant
0,690	0,056	CDP-glycerol glycerophosphotransferase inhibitor
0,661	0,023	Phosphatase inhibitor
0,614	0,001	N-Acetylated alpha-linked acidic dipeptidase inhibitor
0,591	0,127	Phobic disorders treatment
0,536	0,087	Antiischemic, cerebral
0,514	0,033	Anticonvulsant

Результаты прогноза биологической активности исходного трипептида GPE и его фосфинового аналога GPE(phos), осуществленного при помощи программного пакета PASS, показал заметное изменение биологической активности при замене пептидной связи в молекуле трипептида на метиленфосфорильный фрагмент.

Также была использована программа GUSAR (“General Unrestricted StructureActivity Relationships”), позволившая дать прогноз по острой токсичности для крыс (LD50 мг/кг) для полученного соединения GPE(phos) соединений по сравнению с исходным трипептидом GPE (табл. 3).

Таблица 3. Прогноз по острой токсичности для крыс (LD50 мг/кг) для полученного соединения GPE(phos) соединений по сравнению с исходным трипептидом GPE

	ВБ LD50 (мг/кг)	ВВ LD50 (мг/кг)	ПО LD50 (мг/кг)	ПК LD50 (мг/кг)
GPE	1340	1968	3894	1498
GPE(phos)	456	732	2233	256,6

QSAR модели были разработаны для порядка 10000 соединений, протестированных на крысах по четырем видам токсичности – пероральной (ПО), внутривенной (ВВ), внутрибрюшинной (ВБ) и подкожной (ПК). Для оценки острой токсичности для описания структур химических соединений в программе используются дескрипторы многоуровневых атомных окрестностей (MNA – Multilevel Neighborhoods of Atoms) и количественных атомных окрестностей (QNA – Quantitative Neighborhoods of Atoms). В GUSAR для построения моделей используется алгоритм самосогласованной регрессии (SCR).

Согласно классификации острой токсичности Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) оба соединения являются нетоксичными или малотоксичными по всем способам введения (4 и 5 классы токсичности). Однако важно отметить, что наблюдается некоторое увеличение токсичности GPE(phos) по всем способам введения.

Заключение. Таким образом основным результатом настоящей работы стала апробация нового синтетического подхода к получению физиологически активных веществ в ряду соединений пептидного характера, обладающих активностью, путем замены пептидной связи [C(O)NH] изо-стерным метиленфосфорильным фрагментом [P(O)CH 2 ] с обязательным сохранением исходной аминокислотной последовательности. В ходе настоящей работы был получен псевдо-пептид Gly-Pro-[P(O)(OH)CH 2 ]-Glu, фосфиновый аналог известного физиологически-активного трипептида Gly-Pro-Glu, а также были осуществлены прогноз и относительное сравнение биологической активности и токсичности исходного трипептида и его фосфинового аналога.