Фоторегуляция эпигенетической устойчивости томата к грибным заболеваниям

Рекордные урожаи, в 2-6 раз превышающие средние по культуре, свидетельствуют о значительном потенциале сельскохозяйственных растений, который может быть задействован с помощью высокоэффективных агротехнологий (1). Известно, что реализация наследственной информации существенно зависит от внешних факторов и использование резервов контролируемой эпигенетической системой модификационной изменчивости может быть весьма перспективной альтернативой селекции, например при обеспечении вертикальной устойчивости, особенно с учетом частоты мутаций у патогенов, часто опережающей районирование сорта.

Наибольший интерес представляют экологически чистые регуляторные факторы с высокой биологической эффективностью. К таким факторам относится освещенность, качественные и количественные характеристики которой влияют на морфогенез, фототропизм, фототаксис, активность токсинов и фитоалексинов, развитие реакций устойчивости растений на внедрение патогенов (2). Однако перечисленные примеры подразумевают действие в основном ультрафиолетовой части спектра; сведения об эффекте видимого света ограничены. Нам удалось выявить регуляторную роль красного (КС) и синего света (СС) в патогенезе, индуцированном вирусом табачной мозаики (ВТМ) в различных образцах табака и томата (3, 4). Показано, что СС ингибирует споруляцию фитопатогенных грибов, в частности Alternaria spp. и Botrytis spp. (5). S.Z. Islam с соавт. установили, что КС и желтый свет вызывают у растений кормовых бобов ( Vicia faba ) устойчивость к возбудителю серой плесени B. cinerea Pers. за счет существенного подавления прорастания спор и формирования инфекционных гифов из апрессориев (2). По мнению авторов, эти эффекты спектрального света связаны с накоплением антигрибных веществ.

Известно, что КС (λmax = 660 нм) и СС (λmax = 450 нм) — факторы, влияющие на экспрессию гена халконсинтазы, которая является ключевым ферментом флавоноидного метаболизма (6). Флавоноиды, составляющие большую группу полифенольных вторичных метаболитов, играют важную роль в биологических процессах, участвуя в защите растений от биотических и абиотических стрессоров. Входящие в эту группу антоцианины придают растениям-хозяевам устойчивость к возбудителям болезней. Так, устойчивость растений картофеля к бактериальной инфекции поло- жительно коррелирует с содержанием антоцианинов (7). У растений капусты Brassica oleraceae в ответ на инфекцию содержание антоцианинов возрастало 3-кратно, что может быть следствием действия механизмов, сигналами активации которых выступают жасмоновая и салициловая кислоты (8). Некоторые авторы связывают роль антоцианинов в защите от биотических стрессоров с их антиоксидантными свойствами (9).

Использование трансгенных технологий позволило установить четкую связь между экспрессией генов флавоноидных метаболических путей и степенью устойчивости растений. Так, из каллуса риса с введенными генами кукурузы — C1 и R (регуляторные) и C2 (структурный ген халкон-синтазы) получены проростки с повышенным содержанием антоцианинов и устойчивостью к возбудителю пирикуляриоза риса ( Piricularia oryzae ) (10).

Однако активация генов фенилпропаноидного метаболического пути (в том числе халконсинтазы), повышающая устойчивость к биотическим стрессорам, не всегда положительно коррелирует с количеством светозависимых антоцианинов. Например, заражение сорго непатогенным грибом Cochliobolus heterostrophus приводило к усилению синтеза фитоалексинов и снижению содержания светоиндуцируемых антоцианинов в течение 48 ч после инокуляции, то есть спектр метаболитов изменялся (11). Тесная связь гена I, определяющего устойчивость растений фасоли к вирусу желтой мозаики фасоли (ВЖМФ), с геном В , регулирующим синтез хал-консинтазы/халконизомеразы, либо аллельное состоянии этих генов приводит к образованию основного фитоалексина — фасеолина (12).

Поскольку флавоноиды играют важную роль в защите от биотических стрессоров, в современной науке все большее значение приобретают генно-инженерные технологии, позволяющие встраивать структурные или регуляторные гены, блокировать специфические этапы или создавать новые пути метаболизма флавоноидов (13). Однако производство генетически модифицированных растений представляет определенную биологическую опасность из-за слабой прогнозируемости отдаленных последствий использования такого сырья. По нашему мнению, в этой связи более предпочтительно применить подход, основанный на эпигенетической регуляции, то есть реализовать ненаследуемую модификационную изменчивость с помощью регуляторных факторов, обладающих высокой биологической эффективностью, экологической чистотой и низкой энергоемкостью — например, света видимой части спектра, излучаемого полупроводниковыми светодиодами, что позволяет снизить энергопотребление в 20 раз по сравнению с традиционными осветительными приборами.

Цель исследований заключалась в оценке влияния красного и синего света, примененного на ранних этапах развития проростков томата, на последующую чувствительность к грибным болезням на естественном инфекционном фоне, а также в выявлении роли антоцианинов в этом процессе.

Методика. Объектом изучения служили три образца томата Ly-copersicon esculentum Mill. — сорт Дубок селекции Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур (ВНИИССОК, Московская обл.), характеризующийся холодостойкостью, высокой урожайностью и толерантностью к Phytophtora infestans DB, образец Craigella Tm-1/Tm-1, полученный из Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР, г. Санкт-Петербург), несущий гены устойчивости к дикому штамму ВТМ и обладающий повышенной урожайностью, и образец Мо 605 из коллекции маркерных образцов томата (ВНИИИССОК), характеризующийся повышенным накоплением антоцианинов. Семена изучаемых образцов бы- ли получены из генетической коллекции лаборатории молекулярных и га-метных методов селекции ВНИИССОК и высеяны 5 февраля 2008 года. Темновые 5-суточные проростки перенесли в оранжерею с естественным освещением. Дополнительно 15-суточные проростки освещали КС и СС (соотношение 1:2, суммарная интенсивность — 95-100 мкмоль•м-2•с-1). Такое соотношение длин волн в световом потоке было выбрано на основании наших предварительных исследований и работ A.L. Mancinelli с соавт. (14), показавших, что для высокого уровня экспрессии антоцианинов требуется взаимодействие криптохромов — фоторецепторов СС и фитохромов — фоторецепторов КС. Источником спектрального света служила светодиодная панель фирмы «Оптоника» (Россия) (преимущество полупроводниковых светодиодов в том, что они дают узкий диапазон длин волн и практически не нагреваются). Проростки томата досвечивали в климокамере при температуре 22-23 °С в период суток с 1700 до 2400. Таким образом, был создан 16-часовой световой день — оптимальный для проростков томата, причем досвечивание КС и СС дополняло естественное сбалансированное по спектральному составу освещение, необходимое для нормального развития растений. Досвечивание проводили 4 раза до и 14 раз после пикировки. В контроле растения не досвечивали.

Обработанные спектральным светом и стандартные образцы пикировали в горшки, полученную рассаду высаживали в пленочную теплицу. Эксперимент закладывали методом рендомизированных блоков. Комплексную оценку устойчивости к болезням проводили по оптимизированной нами традиционной методике (15) на естественном инфекционном фоне в два срока: 31 июля (в период массового сбора плодов) и 25 сентября (завершение уборки урожая и вегетации). Сроки оценки были приурочены к наибольшей степени проявления заболеваний на естественном инфекционном фоне. Обработку результатов осуществляли методом дисперсионного анализа по известным методикам (16) (пакет прикладных программ Microsoft Excel 2003).

Результаты. Дополнительная обработка спектральным светом 15-суточных проростков способствовала ускорению роста и развития растений (у образцов Дубок и Craigella Tm-1/Tm-1 изменения были значимыми на 1 % уровне, у образца Мо 605 — незначимыми) (табл. 1).

1. Показатели роста и развития проростков разных образцов томата при дополнительной обработке спектральным светом на ранних этапах онтогенеза (пленочная теплица Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур, 2008 год)

Образец	Высота, мм		Число настоящих листьев, шт.	Длина 3-го настоящего листа, мм
	К	КС + СС разница	К КС + СС разница	К КС + СС разница

Мо 605	33,75     50,00	+16,25	3,67      4,12	+0,45	22,70    48,00	+25,30
Дубок	41,80     86,00	+44,20	4,30      5,90	+1,60	49,20    99,00	+49,80
Craigella	Tm-
1/Tm-1	32,00     76,80	+44,80	3,60      5,20	+1,60	34,50    76,00	+47,50
	НСР 01 =18,10		НСР 01 =0,94		НСР 01 =23,09

П р и м е ч а н и е. К — контроль (без досвечивания), КС и СС — соответственно красный и синий свет. Представлены значения х_ср.

В 2008 году в теплицах ВНИИССОК массовое распространение получили фитопатогенные грибы Alternaria solani Sor. и Botrytis cinerea Pers. На устойчивость растений к этим возбудителям оказали влияние как генотип, так и дополнительная обработка спектральным светом. В период массовой уборки урожая у образца Craigella Tm-1/Tm-1 устойчивость растений не изменялась, у сорта Дубок существенно увеличивалась восприимчивость, у образца Мо 605 статистически значимо возросла устойчивость.

• 2.    Степень поражения растений патогенными грибами у разных форм томата при дополнительной обработке спектральным светом на ранних этапах онтогенеза (пленочная теплица Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур, 2008 год)

  Сорт, образец (фактор А)	Степень поражения Alternaria solani по вариантам обработки, балл (фактор Б)			Степень поражения Botrytis cinerea по вариантам обработки, балл (фактор Б)
  	К           1	КС + СС	разность	К          1	КС + СС	1       разность
  	С р о к	о ц е н к и — 31	и ю л я 2 0 0 8 г о д а (массовая уборка урожая)
  Дубок	0,75	1,95	+1,20	0,40	0	- 0,40
  Craigella Tm-1/Tm-1	0,30	0,21	- 0,09	0	0,10	+0,10
  Мо 605	1,50	0,96	- 0,54	0,10	0	- 0,10
  	0,85 С р о к о	1,04 ц е н к и — 25 с	НСР 05 = 0,57 НСР 05 А = 0,40 НСР 05 В = 0,32 е н т я б р я 2 0 0 8 г о д а	0,17 (окончание вегетации)	0,03	НСР 05 = 0,19 НСР 05 А = 0,13 НСР 05 В = 0,11
  Дубок	1,05	3,70	+2,65	1,80	3,00	+1,20
  Craigella Tm-1/Tm-1	2,10	1,70	- 0,40	0,60	1,60	+1,00
  Мо 605	3,70	1,30	- 2,40	2,40	0	- 2,40
  2,28 П р и м е ч а н и е. То же, что в таблице 1. Представлены		2,23 значения хср.	НСР 05 = 0,51 НСР 05 А = 0,36 НСР 05 В = 0,29	1,60	1,50	НСР 05 = 0,67 НСР 05 А = 0,47 НСР 05 В = 0,38

• 3.    Продуктивность растений у разных форм томата при дополнительной обработке спектральным светом на ранних этапах онтогенеза (пленочная теплица Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур, 2008 год)

  
  

  Показатель	Сорт Дубок			Образец Craigella Tm-1/Tm-1			Образец Мо 605			НСР 01
  	К	п КС + СС	разность	К	1 КС + СС	разность	К	КС + СС	разность
  Урожай с куста, г Число плодов с	587,50	707,50	+120,00	1952,78	2558,00	+605,22	1407,50	2303,60	+896,10	505,90
  куста, шт.	10,30	10,00	- 0,30	56,00	57,50	+1,50	23,40	37,90	+14,50	31,02
  Масса плода, г	57,04	70,75	+13,71	34,87	44,48	+9,61	60,15	60,78	+0,63	11,16

П р и м е ч а н и е. То же, что в таблице 1. Представлены значения х_ср

К концу вегетации более четко проявились разнонаправленные реакции у растений сорта Дубок и образца Мо 605, а у Craigella Tm-1/Tm-1 обнаружилось статистически значимое различие между вариантами по фактору световой обработки в пользу опыта (табл. 2).

Неоднозначное влияние досветки на показатели устойчивости к грибам у сорта Дубок и образца Craigella Tm-1/Tm-1 при не вызывающем сомнения увеличении продуктивности свидетельствует, что у этих генотипов досветка КС и СС вызывала проявление толерантности к возбудителям грибных болезней.

По отношению к возбудителю серой плесени Botrytis cinerea Pers. у растений сорта Дубок устойчивость в период массовой уборки урожая существенно возросла, к концу вегетации — значимо снизилась. Это, вероятно, связано со старением растений, причем более ранним именно в варианте с дополнительной световой обработкой. Подобная закономерность отмечалась и у образца Craigella Tm-1/Tm-1 (см. табл. 2).

Образец Мо 605 проявил достоверно большую устойчивость к возбудителю как серой плесени, так и альтернариоза (см. табл. 2). У образца Мо 605 существенное возрастание устойчивости под действием обработки спектральным светом мы связываем с генетически детерминированным повышенным содержанием антоцианинов, которое может быть обусловлено усилением флавоноидного метаболизма. Поскольку ген халконсинтазы регулируется КС и СС, дополнительное облучение растений могло повышать уровень его экспрессии и приводить к активации флавоноидного метаболизма, в том числе этапов, связанных с синтезом фитоалексинов и/или антоцианинов, выполняющих протекторную функцию (7-10).

Световая активация всех процессов роста и развития растений томата приводила к тому, что они раньше проходили фенофазы и вступали в фазу плодоношения, в связи с чем существенно возросла продуктивность в опытных вариантах по сравнению с контролем у всех изученных образцов (табл. 3). У сорта Дубок и образца Craigella Tm-1/Tm-1 повышение происходило в большей степени вследствие увеличения массы одного плода, у мутантного образца Мо 605 — в основном за счет числа плодов на одном растении (см. табл. 3).

Итак, энергосберегающая процедура обработки проростков томата спектральным светом позволила (в пределах модификационной изменчивости) ускорить рост и развитие, вызвать толерантность к грибным патогенам и, как результат, увеличить продуктивность растений.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    Ж у ч е н к о А.А. Адаптивное растениеводство. Кишинев, 1990.

• 2.    I s l a m S.Z., H o n d a Y., A r a s e S. Light-induced resistance of Broad bean against Botrutis cinerea. Phytopathology, 1998, 146: 479-485.

• 3.    Ш а т и л о В.И. Спектральлный свет как регулятор устойчивости к ВТМ у представителей рода Nicotiana. Журн. Рос. об-ва фитопатологов, 2003, 4: 51-57.

• 4.    Ш а т и л о В.И. Действие спектрального света на противовирусную устойчивость растений томата с генами ТМ-1 и ТМ-2 . Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в ХХI веке». М., 2003: 484-494.

• 5.    S a s a k i T., H o n d a Y., U m e k a w a M. e.a. Control of certain diseases of greenhouse vegetables with ultraviolet-absorbing vinyl film. Plant Dis., 1985, 69(6): 530-533.

• 6.    W a d e H., B i b i k o v a T., V a l e n t i n e W. e.a. Interactions within a network of phytochrome, cryptochrome and UV-B phototransduction pathways regulate chalcone synthase gene expression in Arabidopsis leaf tissue. Plant J., 2001, 25(6): 675-685.

• 7.    L o r e n c - K u k u l a K., J a f r a S., O s z m i a n s k i J. e.a. Ectopic expression of

  anthocyanin 5-O-glucosyltransferase in potato tuber causes increased resistance to bacteria. J. Agricult. Food Chem., 2005, 53(2): 272-281.

• 8.    S u d h a G., R a v i s h a n k a r G.A. Elicitation of anthocyanin production in callus cultures of Daucus carota and the involvement of methyl jasmonate and salicylic acid. Acta Physiol. Plant., 2003, 25(3): 249-256.

• 9.    K a n g a t h a r a l i n g a m N., P i e r c e M.L., B a y l e s M.B. e.a. Epidermal anthocyanin production as an indicator of bacterial blight resistance in cotton. Physiol. Mol. Plant Pathol., 2002, 61(3): 189-195.

• 10.    G a n d i c o v a M., K o c h k o A., C h e n L. e.a. Development of transgenic plants expressing maize anthocyanin genes and increased blast resistance. Mol. Breed., 2001, 7: 73-83.

• 11.    L o S.C.C., N i c k o l s o n R.L. Reduction of light-induced anthocyanin accumulation in inoculated sorghum mesocotyls — implication for a compensatory role in the defense response. Plant Physiol., 1998, 48(6): 1063-1066.

• 12.    B e n i n g e r C.W., H o s f i e l d G.L., B a s s e t t M.J. e.a. Chemical and morphological expressionof the B and Asp seedcoat genes in Phaseolus vulgaris . J. Am. Soc. Horticult. Sci., 2000, 125(1): 52-58.

• 13.    B o v y A., S c h i j l e n E., H a l l R.D. Metabolic engineering of flavonoids in tomato ( Solanum lycopersicum ): the potential for metabolomics. Metabolomics, 2007, 3(3): 399-412.

• 14.    M a n c i n e l l i A.L., R o s s i F., M o r o n i A. Cryptochrome, phytochrome and anthocyanin production. Plant Physiol., 1991, 96: 1079-1085.

• 15.    Методические указания по селекции и семеноводству овощных культур, возделываемых в защищенном грунте (томат, перец). М., 1979.

• 16.    Д о с п е х о в Б.А. Методика полевого опыта. М., 1985.

V.I. Shatilo1, I.T. Balashova2, N.A. Ursul2, O.B. Tkachenko1, V.V. Kondrat’eva1, V.F. Pivovarov2

Using semiconductor light-emitting diodes of the total intensity of 95-100 mkmol•m^-2•s^-1 the sprouts of tomato (variety Dubok and sample Craigella Tm-1/Tm-1 with high productivity and resistance to different pathogens and abiotic factors, and marker sample Mo 605) were irradiated with red and blue light at a ratio of 1:2, increasing natural daylight time by 17-24 h. The exposition was shown to accelerate the growth and development of plants, to cause tolerance to fungal pathogens ( Alternaria solani Sor. and Botrytis cinerea Pers.) and to increased productivity by 20-60 %.

Научные конференции

VIII МЕЖДУНАРОДНЫЙ СИМПОЗИУМ «НОВЫЕ И НЕТРАДИЦИОННЫЕ РАСТЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ»

22-26 июня 2009 года, г. Москва

Организаторы: МСХ РФ, РАСХН, РАН, Общероссийская академия нетрадиционных и редких растений (АНИРР), ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур РАСХН, Инсти- тут биохимии им. Баха РАН, Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева

НАУЧНЫЕ СЕКЦИИ СИМПОЗИУМА: