Фрагменты гомологии эндогенных ретровирусов в геномах растений и животных

В последние годы разработано множество методов маркирования полиморфизма различных геномных участков (RFLP — restriction fragment length polymorphism, SNP — single nucleotide polymorphism, AFLP — amplified fragment length polymorphism, SSR-PCR — simple sequence repeats PCR и др.), успешно применяющихся для генотипирования как сортов культурных растений (1-4), так и пород сельскохозяйственных видов животных (5-7). Среди них особое место занимают мобильные элементы, первое и, вероятно, самое главное отличие которых от других структурно-функциональных элементов генома — это способность к перемещению. Высокая скорость транспозиций позволяет предполагать их существенную роль в генерации генетической изменчивости (8).

У растений LTR (long terminal repeat) ретротранспозоны занимают значительную часть генома: у Arabidopsis thaliana — чуть более 7 % (9), у риса — 50 %, у пшеницы — 90 % (10), у кукурузы — 75 % (11).

Sireviruses — одни из древнейших LTR-ретротранспозонов, получивших широкое распространение внутри царства растений. Это единственный представитель семейства Pseudoviridae, члены которого предположительно могут содержать ген, близкий к кодирующему оболочечные бел- ки вирусных частиц (env-подобный ген). К наиболее крупным по размеру (около 11 тыс. п.н.) и подробно изученным элементам Sireviruses относится SIRE-1. Анализ последовательности SIRE-1 показывает, что инсерции указанного ретроэлемента (в частности, в геном кукурузы) произошли недавно (12).

Использование последовательностей мобильных генетических элементов в целях маркирования полиморфизма участков их инсерций может оказаться наиболее эффективным подходом для выявления специфических особенностей генофондов для различных групп организмов, контроля их динамики, что особенно важно в работе с сельскохозяйственными видами.

В этой связи целью работы было изучение возможности использовать терминальные участки эндогенных ретровирусов для выявления сортоспецифичных характеристик у культурных растений, а также генетических особенностей у разных пород крупного рогатого скота.

Методика . Исследования выполняли на однодольных растениях Triticum aestivum и двудольных растениях Glycine soja и G. max . Пшеница была представлена двумя озимыми сортами (Московская 39 — мягкая озимая, Мироновская 808 — мягкая озимая, выведена из яровой) и одним яровым (Омская 36 — мягкая яровая), соя — пятью популяциями вида дикорастущая уссурийская ( G . soja , Приморский край) и сорнополевой формой сои ( G . max , Китай). В анализ также включили представителей заводских и аборигенных пород крупного рогатого скота (всего 97 гол.) — две группы черно-пестрых голштинизированных коров (I группа — с животноводческой фермы «Степаньково», Московская обл., II — из вивария Российского государственного аграрного университета), коровы айширской породы (МКЗ № 1, Московская обл.), якутский (Республика Саха) и красный эстонский скот (СПК «Заря», Псковская обл.).

Для полилокусного генотипирования использовали IRAP-PCR маркеры (IRAP-PCR — inter-retrotransposon amplified polymorphism PCR) (13). Геномную ДНК выделяли с использованием коммерческого набора «ДНК-экстран 1» («Синтол», Россия). ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (Россия) с применением смеси ПЦР-РВ («Синтол», Россия). Условия и стадии ПЦР: первоначальная денатурация — 94 °С, 2 мин; денатурация — 94 °С, 30 с; отжиг — 55 °С, 30 с; элонгация — 72 °С, 2 мин; заключительная элонгация — 72 °С, 10 мин; 35 циклов. Праймерами служили терминальные участки LTR-ретротранспозона SIRE-1 (GCA-GTT-ATG-CAA-GTG-GGA-TCA-GCA). Результаты амплификации оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле (1,5 %) с применением в качестве маркера молекулярных масс ДНК GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus («MBI Fermentas», США) для оценки длины продуктов. Визуализацию продуктов ПЦР-амплификации после окрашивания бромистым этидием проводили под УФ-светом. Для того чтобы избежать грубых ошибок, анализировали область спектра с размером фрагментов ДНК менее 1500 п.н.

Математическую обработку данных осуществляли с использованием компьютерной программы TFPGA. Расчет индекса PIC (polymorphic information content) выполняли по формуле для диаллельных локусов: PIC = 2f (1 - f), где f — частота одного из двух аллелей (14).

Поиск гомологичных последовательностей осуществляли в GenBank с использованием баз данных секвенированных участков, применяя для этих целей набор алгоритмов BLASTn.

Результаты . В связи с широкой представленностью LTR-ретротранспозонов (в том числе SIRE-1) в геномах растений для полилокусного генотипирования в качестве праймера в IRAP-PCR нами была выбрана терминальная область этого мобильного элемента.

В результате IRAP-PCR с праймером к терминальному участку ретроэлемента LTR SIRE-1 мы получили отчетливо воспроизводимые спектры фрагментов ДНК как у сои, так и у пшеницы, причем такие фрагменты находились в одном размерном диапазоне: суммарно до 22 локусов длиной 350-1240 п.н., 26 локусов — 220-1450 п.н. (рис. 1, 2).

Рис. 1. Электрофоретические спектры, полученные в IRAP-PCR с ДНК пшеницы Triticum aestivum озимых (А — Московская 39, Б — Мироновская 808) и ярового (Омская 36) сортов при использовании в качестве праймера терминального участка ретротранспозона LTR SIRE-1: М — маркер молекулярных масс GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder Plus («MBI Fermentas», США).

Рис. 2. Электрофоретические спектры, полученные в IRAP-PCR с ДНК дикорастущей сои Glycine soja разных групп при использовании в качестве праймера терминального участка ретротранспозона LTR SIRE-1: 1-4 —

I группа, 5-8 — II группа; М — маркер молекулярных масс GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder Plus («MBI Fermentas», США).

гментов составили соответственно 0,449 и

Анализируемые группы Glycine обладали высоким полиморфизмом (PICср. = 0,414, P = 91 %) по сравнению с T. aestivum (PICср. = 0,120, P = 65 %; PICср. — усредненное значение индекса PIC по всему спектру ампликонов). С использованием баз данных GenBank был выполнен поиск участков гомологии к фрагменту LTR SIRE-1, послужившему праймером, в се-квенированных последовательностях геномов T. aestivum и G. max и выявлены соответственно 122 и 102 таких участка (табл. 1). У Glycine наиболее полиморфными оказались фрагменты длиной от 350 до 490 п.н. и от 1010 до 1240 п.н. Значения PICср. для этих фра-0,364. У T. aestivum, наобо рот, высокий полиморфизм наблюдался в зоне средних длин (от 520 до

720 п.н. и от 760 до 990 п.н., соответственно PIC_cp . — 0,196 и 0,155). Все тяжелые фрагменты были мономорфными и встречались у 100 % исследованных образцов пшеницы (табл. 2).

1. Число участков, гомологичных терминальным сайтам ретротранспозона LTR SIRE-1, в геномах сои Glycine max и пшеницы Triticum aestivum и их некоторые генетические характеристики по результатам IRAP-PCR

Показатель           |	G . max	|           T. aestivum
Длина генома, млрд п.н.1	1,10	1,78
Число:
найденных гомологичных участков1	122	102
фрагментов ДНК в спектре	15-22	26
PIC усредненный по праймеру	0,414	0,120
P, %	91	65

Примечание. 1 — по данным ; IRAP-PCR — inter-retrotransposon amplified polymorphism PCR, PIC — индекс полиморфного информационного содержания локуса, P — доля полиморфных локусов.

2. Частота ампликонов (ЧА) в спектрах, полученных в IRAP-PCR с праймером, гомологичным терминальному участку ретротранспозона LTR SIRE-1, и значения индекса PIC_л0K у _Cа у сортов пшеницы Triticum aestivum

Длина фрагмента, п.н.	Московская 39		Мироновская 808		Омская 36
	ЧА	1    PIC „окуcа	ЧА	1    PIC „окvcа	ЧА	1 PIC „окvcа
1450	0	0	0,2	0,159	1	0
1420	1	0	1	0	1	0
1370	1	0	1	0	0,4	0,349
1340	0,8	0,483	0	0	0,4	0,349
1210	1	0	1	0	1	0
1130	1	0	1	0	1	0
990	1	0	1	0	1	0
900	1	0	1	0	1	0
810	1	0	0,3	0,300	1	0
790	1	0	0	0	0	0
760	0	0	0,8	0,483	0	0
720	1	0	1	0	1	0
680	1	0	1	0	1	0
630	0,500	0,414	0,800	0,483	1	0
590	1	0	1	0	1	0
570	0	0	0,3	0,3	0	0
550	0	0	1	0	1	0
540	1	0	0	0	0,2	0,189
520	0,300	0,300	0	0	0	0
460	1	0	0,700	0,488	0	0
420	1	0	1	0	1	0
360	1	0	1	0	1	0
320	1	0	1	0	1	0
270	1	0	1	0	1	0
250	0,500	0,414	0,300	0,300	0,200	0,189
220	1	0	1	0	1	0
р, %		15		27		15
Примечание.	IRAP-PCR	— inter-retrotransposon amplified polymorphism PCR,				PIC — индекс по-
лиморфного информационного содержания локуса, P — доля полиморфных локусов.

У Glycine был обнаружен только один мономорфный локус длиной 700 п.н., в среднем же доля полиморфных локусов по спектру составила 93 %, PIC_cp . = 0,414. Это свидетельствует об относительно высоком генетическом разнообразии исследованных групп как внутри рода Glycine , так и внутри одного вида G. soja. При этом у G. max отсутствовал локус длиной 680 п.н., тогда как тот же локус встречался у представителей G. soja.

В результате IRAP-PCR с использованием фрагмента ретротранспозона LTR SIRE-1 в качестве праймера были получены уникальные для каждого из сортов пшеницы спектры фрагментов ДНК. Так, у сорта пшеницы Московская 39 фрагмент ДНК длиной 790 п.н. присутствовал у всех исследованных образцов этого сорта, тогда как у сортов Мироновской 808 и Омской 36 фрагментов такой длины не обнаружили. И наоборот, локус, соответствующий фрагменту размером 550 п.н., не встречался только у сорта Московская 39, у остальных сортов по этому локусу PIC = 1.

Показано, что инбридинг в популяциях растений и дрозофилы, например, приводит к физиологическим и фенотипическим изменениям, которые, как предполагается, обусловлены эпигенетическими эффектами, связанными с попарным взаимодействием хромосом (15). Подобные эпигенетические изменения могут приводить к активации мобильных генетических элементов и, как следствие, к усилению процессов, вызывающих кариотипические модификации, к повышению генетического разнообразия и к эпигенетическим перестройкам, что служит важным источником фенотипической изменчивости (15).

Предложенной гипотезой может частично объясняться высокий полиморфизм внутри локуса у сортов T . aestivum с учетом того, что пшеница — самоопылитель. Известно также, что на долю растений с перекрестным опылением у этого самоопылителя приходится до 3 %, а иногда до 10 % популяции. Кроме того, выявлены формы с повышенной частотой переопыления (от 2,6 до 5 % в зависимости от сорта), и к ним, в частности, относятся сорта озимой мягкой пшеницы мироновской селекции (16). Следовательно, высокая внутрисортовая гетерогенность (высокая доля полиморфных локусов и увеличение индекса PIC) (см. табл. 2) у сорта Мироновская 808 по сравнению с двумя другими сортами может быть обусловлена этим фактом.

В связи с неодинаковой распространенностью у разных сортов наибольший интерес в случае пшеницы представляют локусы, соответствующие фрагментам 790 и 550 п.н., сои — локусы 790, 680 и 550 п.н.

На основании значений генетических дистанций (DN), рассчитанных по методу M. Nej (1972) исходя из частоты ампликонов разной длины в полученных спектрах фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными участками фрагмента ретротранспозона LTR SIRE-1, нами была построена дендрограмма (рис. 3). На ней выделяются два отдельных крупных кластера однодольных и двудольных растений. В кластере однодольных в одну группу обособляются сорта пшеницы Мироновская 808 и Омская 36

Рис. 3. Дендрограмма филогенетического родства между изученными группами растений, построенная на основании частоты ампликонов в IRAP-PCR с праймером, гомологичным терминальному участку ретротранспозона LTR SIRE-1: 1 — Glycine max (Китай); 2-6 — G . soja (Приморский край); 7-9 — Triticum aestivum , сорта соответственно Московская 39, Мироновская 808 и Омская 36.

I (см. рис. 3). Подобная диффе-•---9 ренциация сортов отражает как

7 их фенотипические особенности, так и происхождение. На пример, для сортов Мироновская 808 и Омская 36 общая фенотипическая характеристика — белый безостый неопушенный колос (17), тогда как Московская 39 отличается от них белым остистым неопушенным колосом . При этом озимый сорт Мироновская 808 был выведен из яровой мягкой пшеницы методом группового и массового отбора морфологически однородных растений (18).

Полученные данные свидетельствуют о том, что полилокусное генотипирование по IRAP-PCR маркерам с использованием фрагмента ретротранспозона LTR SIRE-1 в качестве праймера позволяет надежно дифференцировать представителей не только однодольных и двудольных растений, но и разных принадлежащих к ним сортов.

Результаты выполненного нами поиска в GenBank участков гомологии к фрагменту LTR ретротранспозона SIRE-1 с использованием алгоритмов BLASTn свидетельствовали о присутствии таких последовательностей в геномах не только растений, но и млекопитающих. Например, в се-квенированных последовательностях генома крупного рогатого скота выявляется 165 участков с такой гомологией.

Для оценки возможности применения фрагментов ретротранспозонов растений с целью полилокусного генотипирования и контроля генофондов пород сельскохозяйственных животных мы выполнили анализ групп некоторых пород крупного рогатого скота (айширский, красный эстонский, якутский скот, две группы черно-пестрых коров из разных хозяйств) по IRAP-PCR маркерам с использованием терминального сайта ретротранспозона LTR SIRE-1 в качестве праймера. При этом были получены спектры фрагментов ДНК (от 13 до 16 в зависимости от породы) в диапазоне длин 330-1470 п.н. (рис. 4).

Рис. 4. Электрофоретические спектры, полученные в IRAP-PCR с ДНК крупного рогатого скота Bos taurus разных пород при использовании в качестве праймера терминального участка ретротранспозона LTR SIRE-1 : 1-3 — айширский скот, 4, 5 — красный эстонский скот, 6-8 — черно-пестрый скот (I группа), 9-11 — черно-пестрый скот (II группа), 12-14 — якутский скот; М — маркер молекулярных масс GeneRuler^TM 100 bp DNA Ladder Plus («MBI Fermentas», США).

3. Значения индекса PIC_л0K у _Cа в спектрах, полученных в IRAP-PCR с праймером, гомологичным терминальному участку ретротранспозона LTR SIRE-1, у крупного рогатого скота Bos taurus

Длина фрагмента, п.н.	Айширский	Черно-пестрый		Якутский	Красный эстонский
		II группа	I группа
1470	0,325	0,486	0	0,488	0,452
1300	0,500	0	0,465	0	0
1200	0	0	0	0	0
1100	0	0	0	0	0
980	0,325	0,416	0,494	0	0,470
950	0,325	0	0	0	0
820	0,483	0	0,349	0	0
800	0,496	-	0	0,380	0

Продолжение таблицы 3

760	0,121	-	0,349	-	0
720	0	0	0	0	0
640	0	0,330	0,432	0	0
590	0	0	0	0	0
510	0	0	0	0	0
440	0	0	0	0	0
380	0,361	-	0,097	-	0,137
330	0,457	0	0	0	0

Примечание. IRAP-PCR — inter-retrotransposon amplified polymorphism PCR, PIC — индекс полиморфного информационного содержания локуса. Прочерки означают, что локус отсутствует.

Наибольший полиморфизм фрагментов ДНК наблюдался в средней части спектра (760-980 п.н.) у черно-пестрых (I группа) и айширских коров. У остальных пород наиболее полиморфным оказался локус, соответствующий фрагменту размером 1470 п.н. В спектре ампликонов ДНК у черно-пестрых (II группа) и якутских коров отсутствовали локусы длиной 380 и 760 п.н., в то же время они встречались у других пород (табл. 3).

4. Характеристика полиморфизма локусов, выявленных в IRAP-PCR с праймером, гомологичным терминальному участку ретротранспозона LTR SIRE-

1, у крупного рогатого скота Bos taurus

Порода, группа скота	1 PIC локусов	1 P, %
Айширский	0,212	56
Черно-пестрый:
I группа	0,137	38
II группа	0,094	23
Якутский	0,062	14
Красный эстонский	0,066	19

Спектры ампликонов, полученные в PCR с праймером LTR SIRE-1 суммарно по всем локусам, для представителей якут- ской, красной эстонской и чернопестрой (II группа) пород крупного рогатого скота существенно не различались по доле полиморфных локусов (P) и индексу PICср. (соответственно 14, 19 и 23 %; 0,062, 0,066 и 0,094). Наиболее гетерогенной при этом оказалась популяция айширского скота (PICср. = 0,212, P = 56 %) (табл. 4).

Примечание. IRAP-PCR — inter-retrotransposon amplified polymorphism PCR, PIC — индекс полиморфного информационного содержания локуса, P — доля полиморфных локусов. Описание групп см. в разделе «Методика».

Рис. 5. Дендрограмма филогенетического родства между изученными породами крупного рогатого скота Bos taurus , построенная на основании частоты ампликонов в IRAP-PCR с праймером, гомологичным терминальному участку ретротранспозона LTR SIRE-1: 1 — айширский скот, 2 — черно-пестрый скот (I группа), 3 — якутский скот, 4 — красный эстонский скот, 5 — черно-пестрый скот (II группа).

На основании оценок полиморфизма ампликонов построили дендрограмму для исследуемых групп животных (рис. 5). Чернопестрый (I группа) и айширский скот оказались ближе друг к другу, тогда как черно-пестрый (II группа), красный эстонский и якутский обособились в отдельный подкластер. Необходимо отметить, что генетическая дистанция между черно-пестрыми и якутскими коровами была крайне мала (DN = 0,0076). Две группы черно-пестрых коров по генетическим характеристикам (см. табл. 4) имели значительные различия. Б о льшую гетерогенность отмечали у I группы (P = 38 %, PIC_ср . = 0,137). Возможно, это связано с различиями в проводимой селекционной работе или иными факторами как искусственного, так и естественного отбора.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что участки мобильных элементов, в частности LTR SIRE-1, могут применяться в исследованиях генетической структуры у групп и сортов как двудольных (Glycine), так и однодольных (Triticum) растений. Кроме того, такое полилокусное генотипирование фрагментов ДНК, полученных в результате IRAP-PCR с праймером, гомологичным терминальнаму сайту ретротранспозона LTR SIRE-1, позволяет выявлять генетические особенности пород крупного рогатого скота.