Фракционный состав белков и молекулярные формы некоторых дегидрогеназ микросообществ модельных гидроэкосистем

Шаталаев Иван Федорович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой химии фармацевтического факультета

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) занимает одно из ключевых положений в обменных процессах микросообществ активного ила, поэтому данные об активности фермента позволяют судить о скорости функционирования цикла Кребса. В доступной литературе практически отсутствует информация по использованию данных о динамике активности и структурной организации СДГ в мониторинге экосистем. Эти данные могут быть использованы в качестве интегрального показателя оценки физиологического и функционального состояния микросообществ модельных и природных гидроэкосистем. Высокая чувствительность СДГ к действию ксенобиотиков может быть положена в основу одного из методов биомониторинга последних [6].

Цель настоящей работы — исследование фракционного состава белков, структурных особенностей, динамики относительной активности молекулярных форм Гл-6-ФД и СДГ гидроэкосистем активного ила по фазам развития, при моделировании залповых сбросов сточных вод и их компонентов.

Материал и методы исследования. В качестве модельных гидроэкосистем использовали активный ил регенераторов сооружений биологической очистки нефтеперерабатывающего завода. После удаления фоновых загрязнений ил помещали в аэратор периодического действия, исходная концентрация биомассы составляла 0,8-1,0 г/л. Источником углерода в среде являлась глюкоза в концентрации 1 г/л. Фазы развития экосистемы контролировали по показателям оптической плотности и сухому остатку биомассы. На разных фазах имитировали залповые сбросы сточных вод и их компонентов. Получение ферментных образцов, электрофорез, определение молекулярной массы белковых фракций, выявление МФ Гл-6-ФД и СДГ, определение их активности проводили по методикам, описанным в литературе [6].

Результаты и их обсуждение. На всех фазах развития модельной гидроэкосистемы были выявлены три основные фракции белка: первая — «быстромигрирующая» с молекулярной массой 14500-15000; а также две фракции — 43000-50000 и 58000-60000. Из литературных источников известно, что молекулярная масса белков большинства бактерий имеет сравнительно малую величину — до 90000-100000, что согласуется с полученными нами данными. Было отмечено значительное уменьшение количества белка во всех фракциях от фазы адаптации к фазе лог-роста и стационарной фазе — до 70% от первоначальной величины в фазе адаптации.

Необходимо отметить, что в фазе лог-роста происходило увеличение активности неспецифических дегидрогеназ — в 2,5-3,0 раза по сравнению с фазой адаптации. Очевидно, что такие изменения в составе фракций белка обусловлены интенсивным синтезом специфических ферментов в фазе лог-роста и на переходе стационарной фазе. На всем протяжении стационарной фазы и до фазы заката экосистемы количество белка в трех фракциях оставалось на уровне количества фазы лог-роста. В таблице 1 представлены данные о фракционном составе белков микросообществ модельной гидроэкосистемы при имитации залповых сбросов сточных вод нефтехимических производств, их компонентов и соединений Pb, Zn.

Таблица 1. Фракционный состав белков микросообществ модельных гидроэкосистем

Сточные воды, компоненты	Биомасса: сточная вода; концентрация мг/ г биомассы	Контроль		Опыт
		общий белок, %	количество фракций белка	общий белок, %	количество фракций белка
сточные воды НПЗ	1:10	8,32	3	8,12	-
производство СЖК	1:20	7,31	3	8,05	-
производство АСП	1:20	7,31	3	7,10	2
производство карбамида	1:20	7,31	3	7,60	-
СМС «Прогресс»	50,0	7,62	3	7,63	3
	100,0	7,62	3	7,92	1
	150,0	7,62	3	7,56	-
углеводороды	150,0	8,32	3	8,16	1
диизобутил-п-крезол	200,0	8,32	3	7,85	3
гидрохинон	18,0	6,18	3	6,30	2
о-крезол	100,0	6,18	3	6,05	2
фенол	100,0	6,18	3	6,25	2
диизобутил-п-крезол + СМС «Прогресс»	200,0+150,0	8,32	3	8,00	1
свинца ацетат	11,0-19,0	6,92	3	6,54	-
цинка ацетат	18,0-32,0	6,92	3	7,00	-

Примечание: НПЗ — нефтеперерабатывающий завод; СЖК — синтетические жирные кислоты; АСП — алкилсалицилатные присадки

Действие синтетического моющего средства «Прогресс» в интервале концентраций 50,0-150,0 мг/г биомассы вызывало «уход» всех трех фракций белка с электрофореграмм, при этом общее количество белка сохранялось на одинаковом уровне. Аналогичные результаты были получены при имитации залповых сбросов сточных вод цехов производства синтетических жирных кислот и карбамида. Действие солей металлов: свинца и цинка нитрата в концентрациях 11,019,0 и 18,0-32,0 мг/г биомассы соответственно при экспозиции 60 мин вызывало эффект «ухода» белковых фракций с электрофореграмм.

Аэробная стабилизация гидроэкосистемы в течение 24-72 ч после мощного действия токсичных соединений сопровождалась выявлением на электрофореграммах до семи фракций белка с молекулярной массой от 5000 до 20000. Полученные данные подтверждают выводы других авторов о синтезе низкомолекулярных белков в ответ на действие стрессовых концентраций токсикантов.

Представляются интересными качественные и количественные изменения белковых фракций при воздействии на модельную гидроэкосистему диизобутил-п-крезола, который является пищевым и техническим антиоксидантом. Экспозиция 1 час с вышеуказанным соединением приводила к увеличению количества белка во всех фракциях до 40% по сравнению с контролем. Совместное действие диизобутил-п-крезола с СМС «Прогресс» в концентрации 150,0 мг/г биомассы не вызывало уменьшения количества общего белка, однако обнаруживалась только одна белковая фракция.

С увеличением концентрации токсичных компонентов в гидроэкосистемах белки гидробионтов постепенно теряют способность фиксировать специфические красители, что является следствием глубоких изменений структуры белка, величины заряда. Эти данные могут быть положены в основу метода биотестирования токсичности сточных вод промышленных производств.

В фазе адаптации модельных гидроэкосистем активного ила Гл-6-ФД представлена четырьмя активными зонами, причем в третьей зоне выявлено две МФ. В начале фазы лог-роста установлено пять активных зон фермента, при этом количество МФ возрастает с пяти до девяти со следующим распределением по зонам: первая зона — две МФ, вторая — одна, третья — три, четвертая — две и пятая зона активности — одна МФ. В стационарной фазе число МФ составляет семь и остается без изменения вплоть до фазы отмирания (рис. 1).

В водной среде моделей экосистем в фазе адаптации Гл-6-ФД не обнаруживается. В начале фазы лог-роста и до фазы замедленного роста выявлено до семи экзогенных зон вышеуказанного фермента. Наиболее выражена активность низкомолекулярных форм. К стационарной фазе число экзогенных МФ фермента уменьшается до шести, а в конце стационарной фазы выявлено только три МФ Гл-6-ФД. По электрофоретической подвижности экзогенные МФ Гл-6-ФД соответствуют значениям электрофоретической подвижности эндоферментов. Необходимо отметить, что в водной среде на протяжении всего цикла развития экосистемы не выявлена пятая зона активности.

Полученные данные подтверждают наличие пентозофосфатного пути окисления гексоз в моделях микросообществ гидроэкосистем, интенсивность которого возрастает по мере развития экосистемы до стационарной фазы. Изофермент-ный профиль Гл-6-ФД, изменение его гетерогенности и выявление в фазе лог-роста дополнительной зоны активности позволяют предположить наличие механизмов «тонкой» регуляции пентозофосфатного цикла, осуществляемых наиболее динамичными в развивающейся экосистеме низкомолекулярными формами фермента. Максимальная гетерогенность Гл-6-ФД наблюдается в фазе лог-роста. Это может быть объяснено нарастанием разнообразия метаболитов в данной фазе, достижением гомеостаза экосистемы и подготовкой к ее стабилизации.

Рис. 1. Электрофореграммы МФ ГЛ-6-ФД микросообществ модельных гидроэкосистем по фазам развития. Слева направо: фаза адаптации, фаза лог-роста, стационарная фаза, фаза отмирания.

А — концентрирующий гель; В — разделяющий гель; 1-5 — зоны активности

Небезынтересен факт выявления низкомолекулярных форм фермента в водной среде. Наибольшее их число и максимальная активность установлены в фазе лог-роста, затем с развитием экосистемы и переходом в стационарную фазу, активность снижается, также уменьшается и количество экзогенных МФ. Пока преждевременно утверждать истинные ли это экзогенные формы или результат автолиза клеток. Однако отсутствие в водной среде высокомолекулярной формы

Гл-6-ФД-5 позволяет предположить первое. К тому же пик активности МФ ферментов приходится на фазу лог-роста, в которой клетки практически не подвергаются автолизу.

Одним из основных механизмов адаптации гидробионтов к действию стрессоров может быть избирательный синтез МФ ключевых ферментов метаболизма. Наши исследования полностью подтверждают указанный механизм. Моделирование залповых сбросов сточных вод НПЗ и их компонентов приводило к частичному или полному блокированию пентозофосфатного цикла. Реанимация и аэробная стабилизация в течение 24-72 ч сопровождалась синтезом множества низкомолекулярных активных фракций фермента. Наиболее вероятной стрессовой ситуацией для гидроэкосистем является внезапное уменьшение концентрации кислорода в водной среде. Серия экспериментов по установлению изменения гетерогенности МФ Гл-6-ФД в условиях лимитирования экосистемы кислородом показала следующее (табл. 2).

Полученные данные однозначно указывают на увеличение гетерогенности МФ Гл-6-ФД микросообществ гидроэкосистем в условиях лимитирования кислородом, причем, увеличение числа МФ фермента достигается за счет низкомолекулярных форм. Отмечено некоторое снижение относительной активности Гл-6-ФД-4 и Гл-6-ФД-5 по сравнению с контролем при одновременном увеличении таковой у низкомолекулярных форм в первые 3-4 ч после прекращения аэрации. Такое изменение соотношения активности МФ фермента в целом не приводит к снижению эффективности пентозофосфатного цикла. Далее с уменьшением содержания кислорода в экосистеме активность МФ Гл-6-ФД уменьшается, заметны деструктивные процессы в составе зон фермента.

Таблица 2. МФ Гл-6-ФД по фазам развития в условиях лимитирования гидроэкосистемы кислородом

Фазы развития		Количество МФ в зонах активности
		Гл-6-ФД-1	Гл-6-ФД-2	Гл-6-ФД-3	Гл-6-ФД-4	Гл-6-ФД-5
адаптация	контроль	1	-	2	1	1
	опыт	1	2	2	1	1
лог-рост	контроль	2	1	3	2	1
	опыт	2	2	3	2	1
стабилизация	контроль	1	1	3	1	1
	опыт	3	3	3	1	1

СДГ в фазе адаптации модельных гидроэкосистем представлена в составе шести МФ, основная активность фермента локализована в зонах СДГ-2 и СДГ-6. Переход экоситемы в фазу лог-роста сопровождается увеличением числа МФ до семи, также выявляется минорная МФ в области СДГ-6. С переходом в стационарную фазу активность минорной флормы становится незначительной и число МФ становится равным шести. Следует отметить значительные изменения в активности МФ с переходом в стационарную фазу — двухкратное увеличение активности в СДГ-2 и уменьшение таковой в зоне СДГ-6

более чем в 2,5 раза. В стационарной фазе и фазе заката экосистемы активность СДГ-6 достигала уровня активности в фазе адаптации и лог-роста.

Установлены резкие изменения в активности низкомолекулярных форм фермента к завершению стационарной фазы: десятикратная инактивация СДГ-2 и увеличение активности в зонах СДГ-3 и СДГ-4 в 2-3,5 раза. В фазе отмирания вся активность локализуется в области СДГ-3 и СДГ-4 — относительная активность составляет 26,76 и 65,69% соответственно; а число МФ уменьшается до пяти (табл. 3).

Таблица 3. Состав и активность МФ СДГ модельных гидроэкосистем по фазам развития

Адаптация			Лог-рост			Стационарная			Отмирание
МФ	ОЭП	ОА,%	МФ	ОЭП	ОА,%	МФ	ОЭП	ОА,%	МФ	ОЭП	О А, %
1	0,95	6,26	1	0,96	7,80	1	0,96	8,08	1	0,98	1,67
2	0,93	26,35	2	0,92	38,87	2	0,89	3,10	2	0,93	2,68
3	0,62	6,03	3	0,61	9,22	3	0,60	10,64	3	0,59	26,76
4	0,51	5,52	4	0,48	5,47	4	0,47	14,85	4	0,36	65,69
5	0,38	8,59	5	0,36	5,95	5	0,41	7,16	5	-	-
6	0,22	47,25	6	0,21	31,18	6	0,26	58,85	6	-	-
7	-		7	0,10	1,52	7	-		7	0,12	3,21

Примечание: ОЭП — относительная электрофоретическая подвижность; ОА — относительная активность

Полученные данные подтверждают наличие цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) и электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) в микросообществах активного ила модельных гидроэкосистем, интенсивность которых возрастает по мере развития последних. Изоферментный профиль, изменение гетерогенности и активности МФ позволяют предположить наличие тонких механизмов регуляции данных обменных циклов. Максимальная гетерогенность СДГ установлена в фазе лог-роста и на переходе в стационарную фазу, что может быть объяснено нарастанием разнообразия метаболитов в этих фазах, достижением гомеостаза и подготовкой экосистемы к стабилизации.

В водной среде моделей экосистем фермент не обнаружен в фазах адаптации и лог-роста, в стационарной фазе выявлены зоны активности в области СДГ-2 и СДГ-3. В фазе отмирания выявлена одна зона активности в СДГ-2. Выявление в водной среде МФ СДГ может быть объяснено или автолизом клеток микросообщества экосистемы или транспортом низкомолекулярных форм фермента через клеточную стенку.

Отсутствие высокомолекулярных форм СДГ в водной среде на всех фазах развития позволяет предположить второе.

В сериях экспериментов по моделированию залповых сбросов сточных вод нефтеперерабатывающего производства, а также солей свинца полностью подтвердили механизм адаптации микросообществ гидроэкосистем — синтез стрес-сзависимых белков. Моделирование залповых сбросов сточных вод приводило к частичному или полному блокированию ЦТК и ЭТЦ. Реанимация и аэробная стабилизация гидроэкосистем в течение 24-72 ч сопровождалась синтезом множества низкомолекулярных форм СДГ. Моделирование залпового сброса сточных вод, содержащих свинца ацетат в концентрации 3-5 мг/г биомассы приводило к блокированию ЦТК. Реанимация и аэробная стабилизация гидроэкосистемы в течение 48 ч сопровождалось синтезом множества МФ СДГ, однако исходная эффективность ЦТК не была восстановлена. Действие фенола в концентрации 20 мг/г биомассы приводило почти к 2-х-кратной активации фермента. Установленный факт может объясняться дегидрированием фенола в аэробных условиях и образованием п-бензохинона, являющегося акцептором электронов в реакции окисления сукцината. Лимитирование экосистем кислородом приводило к частичной деструкции фракций фермента, значительному снижению активности высокомолекулярных форм СДГ и в целом к снижению эффективности ЦТК.