Фундаментальные аспекты и особенности клинического применения молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных нарушений (обзор)

EDN: HHMZMG

достижениям и проблемам разрабатываемых технологий. Метод анализа дифференциально окрашенных хромосом, также называемый флуоресцентной гибридизацией in situ (fluorescence in situ hybridization - FISH) [1], является «золотым стандартом» в диагностике хромосомных заболеваний. Метод FISH реализуется на основе целенаправленных ДНК-зондов, меченных флуорофором, с последовательностями, комплементарными интересующему участку ДНК [2]. Специфический сигнал усиливается посредством специфической гибридизации меченного красителем ДНК-зонда в сайте-мишени, соответствующем хромосомной аберрации, который впоследствии фиксируется с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако стандартная технология FISH ограничена более низким пространственным разрешением приблизительно 10 млн пар оснований [3], что соответствует уровню обнаружения крупных хромосомных аномалий. Другим существенным недостатком является относительно низкий срок службы красителей, используемых для мечения ДНК-зондов вследствие фотообесцвечивания люминофоров. Перечисленные ограничения, а также относительно высокая стоимость реагентов не позволяют использовать FISH-анализ в качестве метода скрининга. Таким образом, разработка новых и совершенствование существующих платформ в условиях повышения разрешения и надежности ДНК-зондов остается актуальной задачей, решение которой выведет молекулярноцитогенетический анализ на принципиально новый уровень.

Цель – определить ключевые молекулярно-цитогенетические технологии анализа хромосомных нарушений, направленные на своевременную диагностику и мониторинг социально значимых наследственных заболеваний человека.

Методика написания обзора. Систематический обзор выполнен по методологии PRISMA (Preferred reporting items for systematic reviews and metaanalyses – «Предпочтительные элементы отчетности для систематических обзоров и метаанализов») с использованием баз данных PubMed, eLibrary, CyberLeninka, Google Scholar. Глубина поиска – с 2000 по 2025 г.

Поиск проводился по следующим ключевым словам: “molecular cytogenetics”, “chromosomal diseases”, “chromosomal aberrations”, “fluorescence in situ hybridization”, “gene diagnostics”, включая их русскоязычный перевод: «молекулярная цитогенетика», «хромосомные заболевания», «хромосомные аберрации», «флуоресцентная гибридизация in situ », «генетическая диагностика».

Были проанализированы полнотекстовые источники для наиболее точного изучения публикаций, имеющих непосредственное отношение к предметной области обзора. Дублирующие публикации, обзорные статьи, не имеющие детального описания результатов исследований, авторские мнения были исключены из результатов поискового запроса. Преобладающее большинство публикаций по рассматриваемой в обзоре теме представлено в англоязычном секторе. После тщательного фильтра источников по критериям исключения в обзор вошло 50 статей для раскрытия указанной темы (рисунок).

Результаты обзора. Молекулярно-цитогенетический анализ – «золотой стандарт» современной диагностики хромосомных нарушений. Развитие молекулярных методов и подходов получения нативных препаратов хромосом привело к разработке и успешному внедрению зондов для FISH-анализа [4] в рутинную лабораторную практику. С появлением технологии FISH стало доступным выявление хромосомных аномалий, которые выходили за пределы разрешения традиционного анализа полос при кариотипировании [5]. FISH-зонды широко используются в клинической практике на протяжении последних 25 лет для обнаружения микроделеций [6], микродупликаций [7], хромосомных транслокаций [8], обнаружения специфических слияний генов [9], возникающих в результате хромосомных перестроек, подсчета хромосом в интерфазных ядрах [10], количественной оценки уровня транскриптов [11], обнаружение лимфом и других гематологических заболеваний [12], мониторинга первичного опухолевого процесса [13]. В качестве альтернативы методу FISH для диагностики онкогематологической патологии можно рассматривать методы пиросеквенирования [14] и секвенирования нового поколения [15]. Однако оба эти метода, с одной стороны, требуют дорогостоящего оборудования и реагентов для обнаружения расширенных мутаций. С другой стороны, методы секвенирования являются непрямыми и не позволяют визуализировать хромосомные аберрации, а также количественно оценить мутационную нагрузку,

Отбор статей для обзора в соответствии с PRISMA-методологией

нормированную по количеству клеток. С момента изобретения в 1990-х гг. по настоящее время молекулярная цитогенетика претерпела эволюцию от специфических FISH-зондов к отдельным мишеням [16] до полногеномного анализа с появлением методов хромосомной сравнительной геномной гибридизации (comparative genomic hybridization – CGH) [17] и хромосомного микроматричного анализа (chromosomal microarray analysis – CMA) [18]. Несмотря на то что метод CGH изначально использовался для обнаружения дисбаланса числа аберрантных копий по всему геному в образцах новообразований, была продемонстрирована клиническая значимость для пациентов с конституциональными хромосомными аномалиями [19]. В первое десятилетие XXI в. наблюдался рост популярности CMA для повышения диагностической эффективности у пациентов с врожденными аномалиями и умственной отсталостью [20], в то время как CMA для выявления пренатальных [21] синдромов получила развитие только во втором десятилетии 2000-х гг. Следующий крупный сдвиг в технологии анализа хромосом произошел с развитием секвенирования следующего поколения (next generation sequencing – NGS). Методы NGS используется как для таргетной (например, для неинвазивного пренатального генетического тестирования) [22], так и для полногеномной оценки хромосомных аномалий [23], однако оба варианта не могут быть рассмотрены в качестве скрининговых, и требуют существенного биоинформационного постанализа.

Характеристика ДНК-зондов и меток, применяемых для молекулярно-цитогенетического анализа. Эффективность FISH-анализа в современных научных исследованиях и лабораторной практике обеспечивается благодаря следующим особенностям: (1) уникальные ДНК-зонды, которые гибридизуются на соответствующих зонах участков целевых хромосом посредством комплементарного связывания; (2) обширный спектр доступных флуорохромов с широкими спектральными характеристиками и люминесцентными свойствами; (3) высокое пространственное разрешение флуоресцентной микроскопии; (4) частично или полностью автоматизированные аналитический и постаналитический этапы [24]. Еще одним адаптивным преимуществом FISH-анализа является вариабельность совместимых типов биоматериала, включая периферическую кровь, костный мозг, образцы биопсии опухоли, фрагменты плацентарной ткани, эмбриональные ткани или околоплодные воды [25]. Тем не менее имеются определенные ограничения из-за необходимости использования свежеприготовленных препаратов, полученных непосредственно из образцов живых тканей и клеток или после их предварительного культивирования. Для анализа могут быть использованы как метафазные [26], так и интерфазные препараты хромосом [27]. Ключевыми предпосылками успешной реализации метода FISH считаются правильно приготовленные препараты с упорядоченными хромосомами (кариотипом) и эффективно гибридизованный зонд с правильно функционирующей флуоресцентной меткой. Последнее предполагает использование ДНК-зондов, конъюгированных метками со стабильным флуоресцентным сигналом, а также низкое или полное отсутствие неспецифического/фонового окрашивания [28]. Под сигналом понимается пятно, видимое в поле зрения микроскопа, с характерной локализацией в целевом локусе или исследуемой хромосоме [24]. Известно несколько ферментативных методов мечения зондов, включая трансляцию, случайное праймирова-ние [29] и мечение с помощью ПЦР-амплификации. Мечение нуклеотидными аналогами зондов, полученных путем ник-трансляции [30], конъюгации с флуорохромом или гаптеном [31], может быть осуществлено прямым или непрямым вариантами мечения соответственно [19]. Гаптен визуализируют с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом. Непрямое мечение требует дополнительных шагов и реагентов по сравнению с вариантом прямого мечения, и оба варианта имеют свои преимущества и недостатки с точки зрения чувствительности и простоты сигнала.

ДНК-зонды, используемые для молекулярно-цитогенетического анализа, имеют широкий диапазон параметров в зависимости от целевой специфичности, хромосомного расположения анализируемой аномалии, особенностей кластеризации генов и, в некоторой степени, нуклеотидного состава. ДНК-зонды различаются по размеру молекул-мишеней: от перекрывающих всю хромосому до сайт-специфических на конкретную хромосому или локус гена. Согласно одной из классификаций, ДНК-зонды по целевым параметрам можно разделить на ло-кус-специфические зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом [32]; полнохромосомные зонды, позволяющие маркировать всю хромосому и получать дифференциальный спектральный кариотип; зонды, распознающие специфическую целевую последовательность ДНК, которую используют для получения меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом.

Другая классификация основана на химическом строении и способах изготовления ДНК-зондов, согласно которой различают два основных типа: протяженные зонды длиной более нескольких сотен нуклеотидов, и короткие зонды, называемые также олигонуклеотидными ДНК-зондами. Протяженные зонды получают из библиотеки бактериальных клонов (бактериальная искусственная хромосома – bacterial artificial chromosome, BAC) [33], каждый из которых содержит фрагмент ДНК, соответствующий определенному участку генома человека размером ~150 тыс. пар нуклеотидов. Эта технология в первую очередь ограничена доступностью клонов: геном человека состоит из 3 млрд пар оснований, но типичная библиотека BAC включает только примерно 20 тыс. клонов. Это ограничивает выбор зондов и может привести к низкой специфичности зонда в целевой области интереса. Во-вторых, BAC-зонды получены из фрагментированной геномной ДНК человека, поэтому они включают множество встречающихся в природе повторяющихся последовательностей. В-третьих, воспроизведение технологии на основе BAC является трудоемким и дорогим процессом, поскольку используемые последовательности ДНК аналогичны природным и требуют соответствующих ресурсов для обслуживания и биобанкинга.

Компромиссным вариантом ДНК-зондов для FISH-анализа являются олигонуклеотидные зонды – искусственно синтезированные фрагменты ДНК, последовательность которых комплементарна последовательности ДНК хромосом-мишеней [34]. Олигонуклеотидные зонды могут быть сконструированы таким образом, чтобы они обладали специфическими термодинамическими свойствами и были запрограммированы на участки экзогенных последовательностей, которые могут служить доменами «считывания» посредством вторичной гибридизации меченого комплементарного олигонуклеотида. Эти преимущества привели к появлению растущего набора методов пространственных геномики и транскриптомики, в которых используются сложные наборы зондов [35], состоящие из нескольких типов олигонуклеотидов в сочетании с повторяющимися раундами вторичной гибридизации для визуализации десятков геномных областей и тысяч или более типов РНК соответственно в одном и том же образце клетки или ткани. Олиго-нуклеотидные зонды для FISH могут быть разработаны для конкретного участка целевой хромосомы-мишени. WCP-зонды (whole chromosome painting - окрашивание целых хромосом) [36] и представляют собой набор олигонуклеотидных фрагментов ДНК, которые равномерно покрывают хромосому по всей ее длине или только ее часть (например, короткое и длинное плечи). Они гибридизуются на обоих хромосомных гомологах и используются только на метафазных хромосомах, выявляя хромосомные перестройки (транслокации и др.) различной сложности. Центромерные зонды или зонд-счетчик хромосом полностью или относительно специфичны к тандемным a-и в—сателлитным повторам, расположенным в основном в центромерных и око-лоцентромерных гетерохроматиновых областях хромосом [37]. Известен также метод COMBO-FISH (COMBinatorial Oligonucleotide FISH), основанный на перекрывающихся зондах, для чего используется биоинформатический поиск в базах данных последовательностей [38].

Мультицветные и мультиплексные платформы для молекулярно-цитогенетического анализа. Одной из передовых и многообещающих модификаций FISH-анализа является мультиплексная модификация (m-FISH), реализующаяся в виде 24-цветной платформы кариотипирования человеческого генома. Эта платформа была предложена для изучения сложных межхромосомных перестроек и выявления патологических хромосом [39]. Уникальная многоцветная технология основана на трех основных особенностях: (1) мультиплексное мечение всех хромосом в геноме определенным числом спектрально различных флуорофоров комбинаторным способом, так что каждая гомологичная пара хромосом помечается уникальным способом; (2) микроскопическая визуализация и получение цифрового сигнала от каждого флуорофора с использованием специальных наборов однополосных фильтров и специального программного обеспечения m-FISH. Наложение полученных изображений друг на друга, что позволяет классифицировать отдельные хромосомы по составу флуорофоров; (3) детальный анализ и постобработка изображений для устранения структурных и численных аномалий [40]. Другая интересная платформа, разработанная в недавнем исследовании [41], основана на зондах многоцветного окрашивания для каждой пары хромосом. Этот метод позволяет точно определять точки разрыва перестроенных хромосом, внутрихромосомные аномалии (делеции, инверсии, инсерции) и идентифицировать гены-кандидаты, участвующие в нарушении. Известны также и другие мультиплексные технологии FISH, именуемые авторами-разработчиками аббревиатурами, определяемыми как MERFISH, MINA, OligoFISSEQ, OligoSTORM, ORCA, seqFISH+. Подробный анализ перечисленных технологий приведен в недавнем обзоре [42].

Клинически одобренные наборы реагентов для молекулярно-цитогенетической диагностики. Современный перечень средств и методов, включенных в мировые стандарты первичной диагностики и мониторинга гематологических заболеваний, таких как острый и хронический мие-лолейкозы, острый лимфобластный и хронический лимфолейкозы, множественная миелома, миелоди-спластический синдром, неходжкинская лимфома, постоянно обновляется и модифицируется. Тем не менее диагноз методом FISH достоверно фиксируется Всемирной организацией здравоохранения на уровне клинических рекомендаций по указанным нозологиям. Коммерчески доступные наборы реагентов на основе метода FISH для диагностики онкогемато-логических заболеваний, включающие протяженные зонды на основе технологии BAC с возможностью прямого мечения, предложены в США фирмами Abbott (технология VYSlS IntelliFISH) [43] и Leica (технология зондов Kreatech FISH) [44], в Германии – компанией Metasystems (технология многоцветного мечения mFISH) [45]. Одними из наиболее известных производителей реагентов для FISH-диагностики на основе технологий олигонуклеотидных зондов являются Agilent, США, с запатентованной технологией SureFISH [46] и Biosearch Technologies, США (технология Stellaris™ RNA FISH) [47]. Помимо разработки реагентов класса IVD, производители уделяют большое внимание созданию исследовательских наборов и компонентов для молекулярно-цитогенетического анализа как одного из наиболее мощных инструментов современных биомедицинских исследований. В исследовательских целях метод FISH активно используется для изучения патологических процессов в кроветворении. Например, в недавнем исследовании [48] описано применение метода FISH на CD34+-клетках пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом с успешной оценкой цитогенетических изменений в соответствующей фракции CD19+-клеток. Китайская биотехнологическая компания Wuhan Healthcare производит широкий спектр ДНК-зондов для патоморфологических и онкогемато-логических исследований методом FISH и его модификациями. Компания разработала и запатентовала технологию FastProbe® [49], которая позволяет сократить время гибридизации при FISH-анализе с 16 до 2 ч, повысить чувствительность и специфичность зонда, уменьшить фоновое окрашивание и получить четкий и яркий флуоресцентный сигнал. Что касается отечественных разработок, имеются фрагментарные сведения относительно создания тест-систем для клинического молекулярно-цитогенетического анализа [50].

Заключение. В ходе проведенного критического анализа исследований последних десятилетий установлено, что при разработке новых платформ для молекулярно-цитогенетической детекции клинически значимых геномных перестроек ключевой является технология FISH и ее модификации, в частности технология картирования генома на основе CMA, многоцветный FISH для анализа мультихромосом-ных локусов, высокоразрешающий FISH на основе олигонуклеотидных зондов. Обзор будет полезен исследователям, специализирующимся на фундаментальных проблемах патологий генетической этиологии на уровне хромосомных аберраций, понимании функционирования хромосомного аппарата клеточных систем в норме и переходных состояниях соответственно. Кроме того, обобщенная информация будет полезна практикующим клиницистам в вопросе о наиболее перспективных способах рутинной диагностики социально значимых заболеваний с использованием мощных и высокопроизводительных методов, основанных на хромосомном и молекулярно-цитогенетическом вариантах анализа.

Источники финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России «Разработка технологии создания перспективных тест-систем на основе высокоразрешающих флуоресцирующих ДНК-нанометок для молекулярно-цитогенетической диагностики хромосомных болезней» (регистрационный номер 124020300001-9).

Вклад авторов: Т.Е. Пылаев – дизайн статьи, обработка данных, написание и редактирование рукописи; С.С. Веретенников – поиск источников литературы, редактирование рукописи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.