Функциональная морфология надкостницы диафиза большеберцовой кости собаки в зоне повреждения после флексионной остеоклазии

Участие надкостницы в репаративном костеобразовании зависит от способа фиксации и степени стабильности костных отломков [2, 8, 9, 10, 18, 21, 22]. Особое значение в процессах пролиферации и дифференцировки камбиальных остеогенных клеток при заживлении переломов имеет сохранность сосудистой сети надкостницы [3, 4, 7, 14, 31].

Вопрос о роли надкостницы в репаративном костеобразовании при дистракционном остеосинте- зе до настоящего времени нельзя считать полностью решенным. В частности, отсутствуют данные о степени повреждения надкостницы при нарушении целости кости методом флексионной остеокла-зии и о ее строении на ранних этапах остеосинтеза.

Цель работы изучение морфофункциональных особенностей надкостницы у взрослых собак в преддистракционном периоде после выполнения флексионной остеоклазии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для выполнения работы использовали материал 20 взрослых собак. У 14 из них осуществляли флексионную остеоклазию в средней трети диафиза большеберцовой кости (Г.А. Илизаров «Способ остеотомии диафиза трубчатых костей» А.с. 596222, пр. от 3.06.74). Животных выводили из опыта через 1, 3 и 5 суток после операции (хирурги-экспериментаторы: к.м.н. И.И. Мартель и к.м.н. Н.В. Петровская). Контрольная группа животных включала 6 интактных взрослых собак. Уход и эвтаназию животных осуществляли в соответствии с требованиями приказа МЗ СССР № 755 от 12.08.77 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организованных форм работы с использованием экспериментальных животных».1

Большеберцовые кости фиксировали в 2 % растворе параформ-глутаральдегида. Кусочки надкостницы выпиливали вместе с поверхностными участками коркового слоя кости на уровне проксимального и дистального костных отломков и в зоне повреждения диафиза. Часть из них де- кальцинировали и заливали в целлоидин и парафин. Оставшиеся кусочки дополнительно фиксировали в четырехокиси осмия и без декальцинации заливали в аралдит. Целлоидиновые и парафиновые срезы окрашивали гематоксилином-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. Полу-тонкие срезы изготавливали из аралдитовых блоков при помощи алмазных ножей и окрашивали по методу метиленовый синий - ШИК. Ультра-тонкие срезы контрастировали растворами уранилацетата и цитрата свинца и исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100B. Поперечные и продольные распилы костей после заключения в аралдит шлифовали мелкоабразивными материалами. Для изучения фибриллярной структуры надкостницы изготовляли дози- рованно коррозионные препараты, протравливая полированную поверхность распилов 10 % раствором этиолята натрия. После напыления серебром в ионном напылителе IВ-6 препараты исследовали при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-840. Морфометрию толщины слоев надкостницы осуществляли на оцифрованных изображениях целлоидиновых и парафиновых гистологических срезов при помощи компьютерной программы – анализатора изображений «ВидеоТест». Статистическую обработку количественных данных проводили, используя приложения «Microsoft Exсel» программного продукта «Microsoft Office». Достоверность отличий средних значений оценивали при помощи двухвыборочного t-теста с различными дисперсиями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что при закрытой флексионной остеоклазии большеберцовой кости в средней трети диафиза надкостница сохраняла свою целостность по всей окружности кости, за исключением передней поверхности, где она иногда повреждалась в ходе операции острыми краями образовавшихся костных отломков и испытывала деформацию растяжения в результате их смещения. На задней поверхности кости, в местах подведения спицы, происходило локальное сдавливание надкостницы. В участках, расположенных на уровне диастаза, надкостница отслаивалась от коркового слоя отломков (рис. 1).

Рис. 1. Отслаивание надкостницы в зоне образовавшегося диастаза (стрелка) в средней трети диафиза большеберцовой кости. 1 сутки после флексионной остеоклазии. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение 25

Морфофункциональное состояние надкостницы в преддистракционном периоде (1–5 суток после операции) отражало различные фазы воспалительно-репаративной реакции: альтерации, экссудации и пролиферации. Через 1, 3 суток после операции в участках надкостницы, расположенных на уровне перелома, отмечали реактивные процессы, вызванные повреждением при операции. Наблюдали мор- фологические проявления отека, появление обширных гематом (рис. 2). В зонах кровоизлияний выявляли тромбоциты, макрофаги, преципитаты плазмы, фибрин, коллагеновые волокна и коллагеновые фибриллы на различных стадиях мукоидного и фибриноидного набухания.

Рис. 2. Участки гематомы (стрелка) в фиброзном слое надкостницы через 1 сутки после флексионной остео-клазии. Полутонкий срез, окрашивание метиленовым-синим с постановкой ШИК-реакции. Увеличение 63

Тромбоциты располагались одиночно или небольшими группами и имели дисковидную или овальную, эллипсовидную форму (рис. 3).

Большинство тромбоцитов в зонах кровоизлияний находились на различных этапах адгезии (прилипания к поврежденным тканевым структурам) и агрегации (прилипания пластинок друг к другу). При этом тромбоциты изменяли свою форму, превращаясь в шаровидные образования с цитоплазматическими отростками, которые обеспечивали агрегацию пластинок. Процесс агрегации сопровождался образованием в межклеточных пространствах масс фибрина. Отложения фибрина имели форму диффузных аморфных масс, одиночно расположенных тонких нитей или сетчатых структур с прикрепленными к ним форменными элементами крови (рис. 4). В зонах тромбообразования через 5 суток после операции появлялись шиповидные эритроциты (рис. 5). Они приобретали поверхностные выросты в виде шипов, принимая форму тутовых ягод. Современные исследования, выполненные при помощи сканирующей электронной микроскопии, показали, что при различных патологических состояниях, в том числе при повреждении сосудистых элементов и при воспалительной реакции, форма и поверхностная архитектоника эритроцитов претерпевают аналогичные изменения [1, 27].

В участках геморрагий наблюдали многочисленные моноциты и тканевые макрофаги моноцитоидного типа. Они располагались пери-васкулярно, имели крупное округлое или бобовидное ядро и незначительный объем цитоплазмы. В этих участках располагались и более дифференцированные зрелые тканевые моно-нуклеарные макрофаги (рис. 6).

Рис. 3. Агрегация активированных тромбоцитов шаровидной и дисковидной формы в надкостнице на уровне зоны перелома через 5 суток после флексионной остео-клазии большеберцовой кости. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-ШИК. Увеличение 2000

Рис. 4. Массы фибрина, состоящие их переплетенных нитевидных структур (стрелка) в надкостнице, на уровне зоны перелома в средней трети диафиза. 5 суток после флексионной остеоклазии. Полутон-кий срез. Окраска метиленовым синим с постановкой ШИК-реакции. Увеличение 2000

Рис. 5. Шиповидные эритроциты (стрелка) в зоне тромбообразования в участке надкостницы на уровне перелома диафиза большеберцовой кости собаки через 5 суток после флексионной остеоклазии. Электронная сканограмма. Увеличение 9000

Рис. 6. Дифференцированный мононуклеарный макрофаг с длинными цитоплазматическими отростками и многочисленными фаго- и лизосомами Трансмиссионная электронная микроскопия участка микрогеморрагий в надкостнице большеберцовой кости через 3 суток после флексионной остеокла-зии. Увеличение 15000

За счет отечности и разволокнения фиброзного слоя общая толщина надкостницы на уровне концов отломков увеличивалась по сравнению с контролем на 37,7 %, в зоне перелома - на 54,7 %. Толщина фиброзного слоя надкостницы концов отломков возрастала по сравнению с контролем на 24,8 %, в зоне перелома - на 19,22 %, толщина камбиального слоя увеличивалась на 97,6 и 161,64 %, соответственно (табл. 1).

Через 5 суток после операции определялись очаги кровоизлияний, включающие распадающиеся эритроциты, скопления лейкоцитов с хорошо окрашенными ядрами, макрофаги.

В зонах кровоизлияний наблюдали фибриноидное набухание коллагеновых волокон и фибрилл. Значительное их количество, особенно вблизи макрофагов, подвергалось зернистому распаду, лизису и последующему фагоцитозу.

На протяжении всего периода эксперимента отмечали массовый распад и дегрануляцию туч- ных клеток. В этот период появлялись перива-скулярно локализованные многочисленные де-гранулированные тучные клетки (лаброциты -тканевые базофилы) (рис. 7, 8).

Они имели правильную округлую форму, диаметр их в среднем составлял 14-16 мкм. Специфические гранулы лаброцитов располага- вала или выявлялась на некотором отдалении (до 0,8 мм) от щели между отломками.

К 5-м суткам за счет активизации пролиферативных и биосинтетических процессов надкостница значительно утолщалась по сравнению с предыдущим периодом (1, 3 суток после операции) и с контрольными значениями. Ее общая лись в поверхностных участках цитоплазмы и толщина на уровне костных отломков и в зоне находились на различных этапах экоцитоза. Осуществляемая тучными клетками секреция в межклеточную среду регенерирующей надкостницы комплекса физиологически активных веществ, а также их периваскулярное расположение обеспечивало выполнение ими функции локальных короткодистантных регуляторов клеточно-тканевого метаболизма и уровня сосудистой проницаемости в восстанавливающейся после операции надкостнице.

Вблизи от межотломковой щели наблюдали умеренную пролиферацию фибробластических клеток. В контакте с межотломковой щелью выявлялась рыхлая волокнистая, богатая ретикулиновыми волокнами (фиброретикулярная) ткань. Периост по краям костной раны и вблизи нее терял обычную структуру, здесь выявлялась неширокая зона фиброретикулярной ткани. Иногда наблюдалась отслойка периоста, зона фиброретикулярной ткани на концах отломков отсутство- перелома превышала контрольные значения вдвое. При этом показатели толщины фиброзного слоя надкостницы на уровне костных отломков увеличивались на 129,19 %, камбиального – на 74,2 %, в зоне перелома эти величины возрастали на 69,88 % и 168,56 % соответственно.

К концу преддистракционного периода клеточные элементы надкостницы мигрировали в область диастаза, при этом в зоне перелома и прилежащих к ней отделах выявлялись многочисленные малодифференцированные клетки. Они имели округлую или овальную форму, крупное асимметрично расположенное ядро, отростчатую, небольшого объема цитоплазму и цитоплазматические отростки (рис. 9, 10).

Перемещение малодифференцированных клеток по направлению к центру области повреждения описано и другими авторами [27] и, по мнению Коржа А.А. и др. (1972), происходит за счет хемотаксиса [6].

Рис. 8. Дегранулированная, периваскулярная тучная клетка на границе надкостницы и регенерата большеберцовой кости через 5 суток после операции. Трансмиссионная электронная микроскопия. Увеличение 15000

Рис. 7. Дегранулированные тучные клетки в участке надкостницы на уровне диастаза. 5 суток после операции. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-ШИК. Увеличение 2000

Таблица 1

Толщина надкостницы и ее слоев в зоне повреждения и в прилежащих отделах диафиза большеберцовой кости

Срок эксперимента	Толщина (М m), мкм
	Фиброзный слой		Камбиальный слой		Надкостница
	зона костных отломков	зона перелома	зона костных отломков	зона перелома	зона костных отломков	зона перелома
1 сутки	81,5 0,59	81,67 1,64	49,4 1,8	65,41 0,96	130,9 1,8	147,1 1,5
5 суток	157,03 3,6	116,37 4	43,55 0,54	67,14 1	200,6 3,9	186,7 4,9
Контроль	68,5 0,92		25 1,23		95,01 0,1

Рис. 9. Малодифференцированные клетки надкостницы, мигрирующие в область диастаза. Полутон-кий срез. Окраска метиленовым синим с постановкой ШИК-реакции. Увеличение 2000

Рис. 10. Надкостница средней трети диафиза на уровне зоны перелома через 5 суток после флексионной остеоклазии. Черными стрелками отмечены мигрирующие в зону диастаза малодифференцированные фибробластоподобные клетки, белой стрелкой - средние лимфоциты. Полутонкий срез. Окраска метиленовым-синим с постановкой ШИК-рекции. Увеличение 400

В периостальной фиброретикулярной ткани к 3-м и 5-м суткам после операции начиналось формирование трабекул ретикулофиброзной (грубоволокнистой) костной ткани (рис. 11).

По периферии трабекул выявлялась яркая остеоидная кайма, на наружной поверхности которой располагались многочисленные молодые остеобласты и преостеобласты, имеющие значительно вакуолизированную цитоплазму (рис. 12).

Со стороны периоста в область диастаза к этому сроку эксперимента начинали врастать сосуды. Формирующаяся периостальная мозоль в этот период не перекрывала межотломковую щель.

Рис. 11. Формирующиеся в зоне периоста через 3 суток после операции трабекулы ретикулофиброз-ной костной ткани. Стрелкой отмечены располагающиеся на поверхности трабекул молодые остеобласты. Полутонкий срез. Окраска метиленовым-синим с постановкой ШИК-реакции. Увеличение 400

Рис. 12. Остеоидная кайма (стрелка) по периметру более зрелой, костной трабекулы, образованной в камбиальном слое надкостницы через 5 суток после флексионной остеоклазии. Полутонкий срез. Окраска метиленовым-синим с постановкой ШИК-реакции. Увеличение 1000

Таким образом, проведенные исследования показали, что через 1-5 суток после флексионной остеоклазии в надкостнице происходит гиперемия, усиленная серозно-фиброзная экссудация, нейтрофильная инфильтрация, сменяющаяся макрофагальной реакцией, что отражает проявление воспалительно-репаративной реакции и адаптивной регенерации структурных компонентов надкостницы в ответ на травматическое повреждение [16].

Изменение структуры надкостницы в пред-дистракционный период, появление, наряду с клетками фибробластического ряда на уровне зоны повреждения, палочкоядерных лейкоцитов (ПЯЛ), тучных клеток, базофилов, макрофагов, лимфоцитов свидетельствуют о наличии воспалительного процесса [12]. Известно, что указанные клетки вырабатывают тканевые медиаторы воспаления. Они аккумулируются в ответ на операционное повреждение, осуществляют миграцию, фагоцитоз, «контакты» с системой плазменных структур. Тучные клетки и базофилы при дегранулировании высвобождают вазоактивные амины, что ведет к повышению сосудистой проницаемости, экссудации и изменению строения сосудистых мембран и основного вещества соединительной ткани [5]. Макрофаги, кроме выполнения фагоцитарных функций, являются также регуляторами метаболизма в очаге воспаления [24, 25].

Наличие признаков воспаления, пролиферация фибробластов и их миграция, рост сосудов, появление грануляционной ткани, активизация биосинтеза коллагена и фибриллогенеза указывают на единство процессов воспаления и регенерации, которые являются неразрывными компонентами адаптивной тканевой реакции надкостницы на повреждение при флексионной ос-теоклазии. Эта реакция реализуется и регулируется на основе кооперативного взаимодействия клеток соединительной ткани надкоcтницы и крови, а также межклеточного матрикса [20, 26].

Формирование ретикулофиброзной (грубоволокнистой) костной ткани остеогенными клетками надкостницы к 5 суткам послеопера- ционного периода свидетельствует об увеличении их биосинтетической активности к этому периоду, что подтверждают результататы и других исследователей [28].

Таким образом, процессы, происходящие в надкостнице через 1-5 суток после флексионной остеоклазии, имеют защитноприспособительный характер, присущий адаптивной регенерации [15]. При этом структура надкостницы на значительном протяжении сохранялась, что обеспечивало выполнение ею важной барьерной функции, препятствуя врастанию параоссальных мягких тканей в область диастаза. В первые трое суток после операции надкостница в зоне диастаза значительно утолщалась за счет отечности, фибриноидного и мукоидного набухания волокон, а через 5 суток ее утолщение было связано с ангиогенезом, пролиферацией клеток и активизацией синтеза коллагена. Известно, что очаги микрокровоизлияний, отмечаемые нами в участках надкостницы на уровне перелома, замедляют периостальный остеогенез [19]. Вместе с тем, уже через 3-5 суток после операции индуцибельные остеогенные клетки камбиального слоя надкостницы формировали трабекулы ретикулофиброзной костной ткани.