Функционально-метаболический статус нейтрофильных фагоцитов у пациентов с заболеваниями суставов перед первичным и ревизионным эндопротезированием

Главная задача эндопротезирования любого сустава – обеспечение его безболезненного и долговременного функционирования. Эндопротез представляет собой механическую систему, не обладающую способностью к саморегенерации, поэтому срок «выживания» большинства искусственных суставов ограничен, что связано с различными факторами, одним из которых является реакция иммунной системы на присутствие имплантата [1, 2].

Имплантация искусственного сустава у больных с остеоартрозом сопряжена с формированием иммунологического дисбаланса, способствующего развитию послеоперационных осложнений. Одним из наиболее частых и серьезных поздних осложнений эндопротезирования является асептическое расшатывание компонентов эндопротеза, которое, по литературным данным, достигает 30 % и требует ревизионного вмешательства [2, 4, 8].

Одной из причин возникновения асептического воспаления является миграция частиц износа про- теза и костного цемента (дебриса) в окружающие ткани, в результате чего происходит приток фагоцитарных клеток (макрофагов и нейтрофилов) в зону имплантации [9,11]. Избыточная активация нейтрофилов оказывает повреждающее действие на ткани сустава при остеоартрозе, а также играет существенную роль в процессе резорбции на границе «кость – эндопротез» посредством выделения протеолитических и гидролитических ферментов, а также активных форм кислорода, способствуя дальнейшей дестабилизации компонентов эндопротеза [5, 7, 10]. Поэтому большую актуальность приобретает комплексное изучение функциональных особенностей нейтрофилов у больных с заболеваниями крупных суставов на этапах эндопротезирования.

Цель работы – исследование функционально-метаболической активности нейтрофилов при подготовке к эндопротезированию и при развитии асептической нестабильности искусственного сустава.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследовано 40 пациентов с остеоартрозом        дии в возрасте от 28 лет до 71 года, которым было

(ОА) коленного и тазобедренного суставов III ста-        выполнено первичное эндопротезирование. В число обследованных лиц вошли 20 пациентов до эндопротезирования и 20 пациентов с развившейся через 2-7 лет после имплантации асептической нестабильностью. В качестве контрольных использовались иммунологические показатели 21 добровольца аналогичного возраста, у которых отсутствовали клинические проявления остеоартроза.

Забор крови осуществлялся из локтевой вены натощак.

Применялась методика изучения фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН), основанная на количественном определении поглотительной и переваривающей способности нейтрофилов по отношению к микробной тест-культуре (Staphylococcus epidermidis, штамм № 9198, НИИЭМ). Рассчитывались следующие показатели ФАН:

• 1.    Фагоцитарный показатель (ФП) – процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе от общего их количества (норма – 65-100 %).

• 2.    Фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число микробов, поглощенных одним нейтрофилом. Характеризует поглотительную способность нейтрофилов (норма – 6-14 у.е.).

• 3.    Для оценки переваривающей функции нейтрофилов использовали индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) (норма: ≥ 1) и показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) (норма – 65-100 %).

• 4.    Количество активных фагоцитов (КАФ) – абсолютное число фагоцитирующих нейтрофилов

• 5.    Абсолютный фагоцитарный показатель (АФП) (фагоцитарная емкость крови) – количество микробов, которое могут поглотить фагоциты 1 литра крови (норма – 20-100 109/л).

• 6.    Метаболическую активность нейтрофилов оценивали в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) методом световой микроскопии по методу Park, в двух вариантах: спонтанном и стимулированном.

• 7.    Лизосомальную активность нейтрофилов определяли, используя цитохимическое исследование клеток. Активность миелопероксидазы (МП) определялась по Грехему-Кнолю. Уровень лизосомальных катионных белков (КБ) цитоплазмы устанавливали в реакции с бромфеноловым синим. Уровень МП и КБ выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) [6].

(норма – 1,35-6,4 109/л).

Для морфологического исследования использовали мазки крови.

Полученные данные обрабатывались с помощью методов непараметрической статистики с использованием U-критерия Вилкоксона и были представлены в виде медиан и интерквартильных размахов. Факторный анализ проводили с помощью программного обеспечения AtteStat. Нормальность выборок определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для построения исходной корреляционной матрицы использовали коэффициент Пирсона [3].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ полученных данных показал следующее: у пациентов с остеоартрозом III стадии в доопераци-онном периоде абсолютное количество нейтрофилов и количественные показатели фагоцитоза не имели достоверных отличий от значений контрольной группы (табл. 1, 2). Значения HCT-теста и катионных белков превышали контрольные, что в целом свидетельствовало об усилении бактерицидной активности нейтрофилов, связанной с накоплением продуктов разрушения костного матрикса в тканях сустава.

У пациентов с асептической нестабильностью в период подготовки к ревизионному вмешательству абсолютное количество нейтрофилов в периферической крови было выше, чем в контроле (табл. 1), не выходя при этом за пределы границ физиологической нормы. Относительное содержание активированных нейтрофилов (ФП) было достоверно выше, чем в контрольной группе и у пациентов с остеоартрозом. Вместе с тем усиливалась способность нейтрофилов к кислородзависимому киллин-гу, что нашло свое отражение в повышении ПЗФ, НСТ-теста (табл. 2). Уровень катионных белков и миелопероксидазы достоверно не отличался от значений контрольной группы.

Исследования, проведенные методом полимеразной цепной реакции, доказали присутствие различных видов ассоциированной микрофлоры в тканях, окружающих эндопротез. При этом, ¾ протезов, удаленных при ревизии, оказались инфицированными, тогда как традиционными мето- дами выявлялось не более 10 % инфицированных имплантатов [12]. Опираясь на эти данные, мы предполагаем, что изменения фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов у пациентов с асептической нестабильностью имплантата связаны не только с поступлением продуктов износа эндопротеза в окружающие ткани, но и наличием персистирующей микрофлоры.

Более полное представление об изучаемых иммунологических показателях и стоящих за ними патологических процессах возможно получить с помощью специальной математической обработки результатов исследования.

Проведен факторный анализ у пациентов с остеоартрозом III стадии. Все показатели группировались в ряд факторов, расположенных в порядке уменьшения их вкладов в общую дисперсию. На основании варимаксного нормализованного вращения были выделены 4 фактора, имеющие наибольшую значимость и определяющие вариации ФАН на 83,45 % (табл. 3).

Фактор I, составляющий 31,37 % всех возможных состояний, объединил показатели, характеризующие функционально-метаболическую активность нейтрофилов (НСТ-тест спонтанный, индекс стимуляции НСТ-теста, миелопероксидазу). Обратная линейная зависимость была выявлена между спонтанным НСТ-тестом и индексом стимуляции НСТ-теста, что свидетельствует о сниженных резервных возможностях окислительной системы нейтрофилов.

Таблица 1

Количество нейтрофилов в периферической крови у больных с суставной патологией на этапах лечения

	Лейкоциты (109/л)	Нейтрофилы (%)	Нейтрофилы (109/л)
До эндопротезирования	7,3 (5,5÷7,5)	56 (51,5÷63,5)	3,4 (3,1÷4,1)
Асептическая нестабильность	6,5 (5,2÷8,0)	54,0 (52,0÷65)	3,8+ (2,8÷4,7)
Контрольная группа	5,7 (5,2÷6,2)	54,0 (48,5÷58,5)	3,1 (2,5÷3,7)

Примечание: + - p<0,05 - относительно показателей контрольной группы.

Таблица 2

Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови у пациентов с суставной патологией на этапах лечения (медианы и интерквартильные размахи)

	ФП (%)	ФЧ (у.е.)	КАФ (109/л)	АФП (109/л)	ИЗФ	ПЗФ (%)	НСТ-тест (спонт.) (%)	НСТ-тест (стим.) (%)	НСТ-тест, индекс стимуляции	МП, СЦК	КБ, СЦК
До эндопротезирования	77,0+ 70,0÷82,0	8,0+ 7,0÷10,0	2,6 2,3÷3,0	26,4 22,0÷38,0	1,8 1,6÷2,0	77,0 72,0÷87,0	8,0+ 7,75÷12,0	76,0+ 70,0÷81,3	9,0 5,9÷10,8	2,1 1,8÷2,3	2,3+ 2,2÷2,4
Асептическая нестабильность	87,0+,* 74,3÷90,5	8,5+ 7,0÷9,25	3,1+ 2,0÷3,9	31,0+ 19,8÷39,0	1,7 1,6÷2,1	87,0+ 82,0÷90,0	9,0+ 7,0÷10,25	74,0+ 65,8÷80,0	8,5 6,2÷10,5	2,2 2,0÷2,5	2,1 2,0÷2,2
Контрольная группа	71,5 68,0÷77,3	7,3 7,0÷8,0	2,35 1,8÷2,8	24,0 20,0÷29,5	1,7 1,6÷1,8	82,0 80,0÷86,0	5,5 4,25÷8,0	57,0 48,0÷62,3	9,3 6,9÷9,25	2,0 1,9÷2,3	2,0 1,9÷2,2

Примечание: + – p<0,05 - относительно показателей контрольной группы; * – p<0,05 – относительно показателей, зарегистрированных до имплантации.

Таблица 3

Матрица факторных нагрузок показателей фагоцитарной активности нейтрофилов у больных остеоартрозом III стадии в дооперационном периоде

Показатели	Фактор I	Фактор II	Фактор III	Фактор IV
НСТ–спонтанный (%)	0,93
Индекс стимуляции НСТ	-0,95
Миелопероксидаза, СЦК	0,65			0,6
НСТ–стимулированный (%)		0,77
Катионные белки, СЦК		-0,97
Фагоцитарное число (у.е.)			0,94
Абсолютный фагоцитарный показатель (109/л)			0,94
Выделенные дисперсии (%)	31,37	23,74	17,37	10,97

Фактор II (23,74 % от общей дисперсии) влиял на способность нейтрофилов осуществлять цитотоксическую функцию по отношению к антигенному раздражителю. Обратная корреляция между НСТ-стимулированным тестом и содержанием катионных белков в нейтрофилах свидетельствовала о том, что при остеоартрозе активируются как кис-лородзависимые, так и кислороднезависимые механизмы киллинга.

III фактор составил 17,37 % вклада в общую дисперсию и объединил количественные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов (КАФ и АФП).

IV фактор (10,97 % вклада в общую дисперсию) связан с миелопероксидазой, которая является ключевым ферментом при образовании ряда активных форм кислорода, а также играет ведущую роль в реализации биологической активности перекиси водорода.

Проведенный факторный анализ группы пациентов с асептической нестабильностью эндопротеза позволил выделить 5 значимых для рассмотрения факторов (из 11 основных), вклад которых в общую дисперсию составил 84,2 % (табл. 4).

Фактор I составил наибольший вклад в общую дисперсию – 41,1 %. Он объединил основные показатели активации нейтрофильных фагоцитов – ФП и ПЗФ.

Фактор II (18,8 % от общей дисперсии) связан с показателями, характеризующими функциональнометаболическую активность нейтрофилов – спонтанный НСТ-тест и индекс стимуляции НСТ-теста.

Факторы III, IV, V имели примерно равные вклады в общую дисперсию (8,91 %, 8,4 %, 7,0 % соответственно). Фактор III связан с переваривающей функцией нейтрофилов, IV фактор – с повышением количества активных фагоцитов, фактор V – с поглотительной способностью нейтрофилов.

Таблица 4

Матрица факторных нагрузок показателей фагоцитарной активности нейтрофилов у больных с асептической нестабильностью эндопротеза перед ревизионным вмешательством

Показатели	Фактор I	Фактор II	Фактор III	Фактор IV	Фактор V
Фагоцитарный показатель (%)	0,73
Показатель завершенности фагоцитоза (%)	0,89
Индекс завершенности фагоцитоза			0,97
НСТ – тест (%)		0,94
Индекс стимуляции НСТ		- 0,82
Количество активных фагоцитов (10 9 / л)				0,70
Фагоцитарное число (у.е.)					0,81
Выделенные дисперсии (%)	41,1	18,79	8,91	8,4	7,0

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты факторного анализа показали, что при остеоартрозе III стадии основными являются факторы, влияющие на состояние бактерицидной функции нейтрофилов, которая характеризуется активацией как кислородзависимых (НСТ-тест), так и кислороднезависимых (КБ) механизмов киллинга нейтрофилов.

В обеих группах наблюдается усиление функционально-метаболической активности нейтрофилов, что связано с общей направленностью действий иммунных клеток – инактивацией и элиминацией патогена, независимо от природы его происхождения (продукты разрушения костного матрикса, частицы дебриса или микробные клетки). При развитии асептической нестабильности эндопротеза на фоне активации фагоцитоза и усиления переваривающей функции фагоцитов начинает превалировать кислородзависимый метаболизм нейтрофильных фагоцитов. Следовательно, в отдалённые сроки после эндопротезирования крупных суставов наиболее диагностически значимыми становятся следующие показатели фагоцитарной активности нейтрофилов: ФП, ФЧ, ПЗФ, НСТ-тест, КБ.