Функциональное состояние Saccaromices Cerevisae после фемтосекундного лазерного излучения

Введение. ^∗ Изучение влияния различных физических факторов на биологическую активность ценных микроорганизмов, таких как дрожжи, имеет большое теоретическое и практическое значение. Дрожжи (Saccaromi-ces Cerevisae) являются удобной моделью, применяющейся при многочисленных фотобиологических исследованиях в качестве альтернативы клеточным культурам и экспериментальным животным [13, 14]. Различают 2 основные группы способов активации дрожжевых клеток: химические (антимикробные и ферментные препараты; минеральные вещества Zn, Fe, Cu, Se) и физические (температура, оптическое излучение, ультрафиолет; комплексная обработка дрожжей молекулярным кислородом и магнитным полем и др). В серии экспериментальных работ по облучению S. Cerevisae доказано, что эффект

^∗ Работа поддержана грантом государственного задания Минобрнауки России.

лазерного воздействия на дрожжевые клетки неоднозначен, зависит от дозы, времени облучения и температурных режимов [5, 6]. В работах Ж.К. Усембаевой установлено, что лазерное излучение с длиной волны 632,8 нм может служить фактором оптимизации в управлении процессами метаболизма [4]. Э.Ш. Исмаиловым исследовано влияние лазерного излучения на рост, развитие и продуктивность дрожжевых микроорганизмов. Показано, что при определенных параметрах лазерное излучение оказывает стимулирующее, благоприятное воздействие, которое выражается в увеличении биомассы дрожжей и повышении их энергии брожения при выращивании на жидких питательных средах [2]. Актуальным является изучение возможности использования фемтосекундных лазерных импульсов (ФСЛИ) в биомедицинских исследованиях ввиду предполагаемого отсутствия термического эффекта, высокой пиковой мощности (кВт) при низкой средней (мВт).

Исследований по изучению влияния фемтосекундных лазеров на морфофункциональное состояние S. Cerevisae в доступной нам литературе не найдено.

Цель исследования. Оценка влияния фемтосекундного лазерного излучения на морфофункциональное состояние S. Cerevisae.

Материалы и методы. В исследовании использована суточная культура Saccaromi-ces Cerevisae. Жидкая питательная среда для культивирования клеток состояла из 2 % сахарозы, 2 % пептона и 1 % дрожжевого экстракта. Характеристики используемого фемтосекундного лазера: длительность импульса – 82·10^-15 с; частота следования импульсов – (200–250)·10^-15 с^-1, средняя мощность – 1,26 мВт; пиковая мощность – 6 кВт; длина волны – 1550 нм. Облучение проводилось в пластиковых чашках Петри диаметром 35 мм на расстоянии 7 см от световода лазера. Интенсивность облучения составила 0,82 Вт/см². Плотность потока энергии при этом составила 0,49, 0,74, 1,47, 2,95 Дж/см² при экспозиции соответственно 10, 15, 30, 60 мин. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по уровню вторичного продукта – малонового диальдегида (МДА) в тесте с тиобарбитуровой кислотой спектрофотометрически при 535 нм [1]. Активность каталазы определяли по А.И. Карпищенко [3]. Для определения соотношения глутатиона окисленного и восстановленного использовали спектрофотометрический метод, основанный на окислении GSH 2-нитро-5-ти-обензойной кислотой [10]. Для оценки топологии и ригидности мембраны S. Cerevisae использован метод сканирующей зондовой микроскопии (SolverPro, NT-MDT, Россия). Применялись фирменные кремниевые зонды с жесткостью 0,2 Н/м, радиус закругления кончика составлял 10 нм. Дрожжевые клетки сканировались в полуконтактном режиме. Ригидность мембран оценивалась по модулю Юнга, который рассчитывали согласно теории Герца [8].

Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни, коэффициента корреляции Спирмена с применением программы Stata 6.0.

Результаты и обсуждение. Реакции биологической системы на лазерное излучение в видимой и ближней ИК-областях связаны с физическими и химическими модификациями в фотоакцепторных молекулах, компонентах дыхательной цепи [9]. Такие изменения могут быть следствием изменений окислительно-восстановительных свойств и ускорения переноса электрона, изменения биохимической активности из-за переходного локального нагрева хромофоров, одноэлектронного автоокисления. Для достижения фотобиологических макроэффектов могут быть активированы различные пути протекания реакций. Каскад клеточных биохимических реакций, следующих за основными физическими и/или химическими изменениями, индуцируется светом в фотоакцеп-торных молекулах, которые не требуют добавочного света для активации. Эти эффекты связаны с изменениями гомеостаза клетки. Кроме того, важными являются окислительно-восстановительные процессы: увеличение окисления связано с увеличением жизнеспособности клетки, а снижение окисления – с торможением. Клетки с более низким рН, при котором окислительно-восстановительный статус снижается, более чувствительны к возбуждающему действию света, чем клетки с нормальными параметрами.

С химической точки зрения, оксидатив-ный стресс представляет собой значительное увеличение клеточного редокс-потенциала или существенное снижение восстановительной способности клеточных редокс-пар, таких как окисленный/восстановленный глутатион [7].

Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о дозозависимом увеличении содержания продукта ПОЛ – малонового диальдегида, которое наблюдается только при 1,47 и 2,95 Дж/см2. При небольших значениях плотности потока энергии (0,49 и 0,74 Дж/см2) данные статистически значимо от контроля не отличаются.

Изучение активности фермента эндогенной антиоксидантной системы – каталазы – в культуральной среде S. Cerevisae после воздействия ФСЛИ показало, что наблюдается незначительное снижение активности иссле- дуемого фермента, наиболее выраженное при 1,47 Дж/см2 (табл. 1). Таким образом, возрастание уровня МДА при одновременном снижении активности каталазы позволяет предполагать возникновение оксидативного стресса при ФСЛИ в дозах 1,47 и 2,95 Дж/см2. ФСЛИ стимулирует ПОЛ только при накоплении определенной дозы световой энергии.

Данные, представленные на рис. 1, свидетельствуют о статистически значимом снижении ригидности и, соответственно, об увеличении упругих свойств мембраны клеток S. Cerevisae после ФСЛИ. Изменения наблюдаются при всех изученных плотностях потока энергии.

Таблица 1

Параметры системы «перекисное окисление липидов – антиоксиданты» в культуре S. Cerevisae после ФСЛИ при разных плотностях потока энергии

Параметр	Контроль	Плотность потока энергии, Дж/см2
		0,49	0,74	1,47	2,95
Каталаза, ммоль/мин/л	0,560±0,061	0,480±0,043	0,450±0,047	0,370±0,041*	0,390±0,044*
МДА, мкмоль/л	9,68±0,43	9,74±0,50	9,57±0,49	14,06±1,25*	13,36±0,98*

Примечание. * – данные статистически значимо отличаются от контрольных.

Рис. 1. Ригидность мембраны S. Cerevisae после различных доз ФСЛИ

Изучение окислительно-восстановительного потенциала клеток S. Сerevisae по уровню GSSG/GSH показало, что наиболее выраженные изменения наблюдаются при 0,49 Дж/см2 – 0,204±0,058 и при 1,47 Дж/см2 – 0,198±0,070, что статистически значимо ниже контрольных данных – 0,341±0,090. Таким образом, изменение окислительно-восстановительного потенциала S. сerevisae после воздействия ФСЛИ свидетельствует о снижении уровня восстановленного глутатиона, что ряд авторов связывает с развитием окси-дативного стресса [11, 12].

Анализ корреляционных связей между уровнем GSSG/GSH и процентом делящихся клеток после различных доз ФСЛИ показал, что накопление GSSG и снижение GSH, свидетельствующие о возникновении оксида- тивного стресса, наиболее выражены при ФСЛИ в дозах 0,49 и 1,47 Дж/см2 и коррелируют со снижением процента делящихся дрожжевых клеток.

Заключение. Таким образом, можно предполагать возможность изменения морфофункционального состояния дрожжевых клеток при воздействии ФСЛИ в диапазоне использованных доз.

radiation on yeast cell suspensions / S. Anghel [et al.] // Proc. of SPIE. – 2000. – Vol. 4068. – P. 758–764.

• 7.    Friedmann H. SPIE Proceedings / H. Friedmann, R. Lubart // Effects of Low-Power Light on Biological Systems. – 1996. – Vol. 2630. – P. 60–64.

• 8.    Henderson R. M. Pushing, pulling, dragging, and vibrating renal epithelia by using atomic force microscopy / R. M. Henderson, H. Oberleithner // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2000. – Vol. 278 (5). – Р. 689–701.

• 9.    Karu T. I. Biophysical basis of low-power-laser effects / T. I. Karu // Proceedings of SPIE. – 1996. – Vol. 2802. – P. 142–151.

• 10.    Khramtsov V. V. Esr study of proton transport across phospholipid vesicle membranes / V. V. Khramtsov, M. V. Panteleev, L. M. Weiner // J. Bioch. Biophys. Methods. – 1989. – Vol. 18. – P. 237–246.

• 11.    Shackelford R. E. Oxidative stress and cell cycle checkpoint function / R. E. Shackelford, W. K. Kaufmann, R. S. Paules // Free Radic. Biol. Med. – 2000. – Vol. 28 (9). – P. 1387–1404.

• 12.    Shapira M. Disruption of yeast forkhead-associated cell cycle transcription by oxidative stress / M. Shapira, E. Segal, D. Botstein // Mol. Biol. Cell. – 2004. – Vol. 15 (12). – P. 5659–5669.

• 13.    Stаnеscu C. Competing phenomena in laser effects on the growth of yeast cell colonies / C. Stа-nescu, S. Anghel // J. of Optoelectronics and Advanced Material. – 2002. – Vol. 4, № 1. – Р. 129–134.

• 14.    Tashiro H. Yeast, a convenient model system to study the biological effects of laser irradiation / H. Tashiro, G. Lazarova // Focused on Microbial Diversity. – 1993. – Vol. 3. – Р. 37–38.

FUNCTIONAL STATE OF SACCAROMICES CEREVISAE AFTER FEMTOSECOND LASER IRRADIATION

D.R. Dolgova, T.V. Abakumova, A.V. Fomina, O.S. Voronova

Ulyanovsk State University