Функциональное состояние системы глутатиона в жировой ткани крыс при метаболическом синдроме

Как известно, метаболический синдром (МС) характеризуется комплексом клинико-лабораторных маркеров, ассоциированных с инсулинорезистентностью и ожирением [1–3]. Одним из основных проявлений дисфункции клеточных элементов жировой ткани (адипоцитов и клеток стромально-сосудистой фракции) при ожирении является нарушение их секреторной активности, которое характеризуется усилением наработки провоспалитель-ных и снижением продукции противовоспалительных факторов [4]. Существует прямая связь между хроническим воспалением, индуцированным клетками жировой ткани, и развитием окислительного стресса [5, 6]. Исследования подтверждают тот факт, что медиаторы хронического воспаления формируют и усиливают реакции окислительного стресса, что делает его неотъемлемым патогенетическим фактором ожирения и его возможных осложнений, таких как сахарный диабет 2-го типа, сердечно-сосудистые заболевания [7].

Несмотря на то, что активные формы кислорода (АФК) выполняют важную роль регуляторов в многочисленных межклеточных сигнальных каскадах, их высокая концентрация может опосредовать повреждение клеточных компонентов и вызвать нарушение внутриклеточного метаболизма [8]. Поддержание на определенном уровне внутриклеточных механизмов антиоксидантной защиты обеспечивает динамическое равновесие системы генерации свободных радикалов [9, 10]. Одним из них является система глутатиона, включающая восстановленную (GSH) и окисленную (GSSG) формы трипептида, а также антиоксидантные ферменты (глутатионредуктазу, глутатионпероксидазу, глутатион-S-трансферазу) [11]. Сведения о ее роли в контролировании окислительно-восстановительного равновесия в клетках жировой ткани немногочисленны и главным образом сводятся к изучению активности отдельных антиоксидантных ферментов [12, 13].

Цель исследования: изучение функционального состояния компонентов глутатион-зависимой антиоксидантной системы в жировой ткани крыс при экспериментальном МС.

Материал и методы

Модель диет-индуцированного МС была воспроизведена на 12 крысах-самцах аутбредной линии Wistar (масса – 242,3 ± 38,5 г; возраст – 6 нед. на начало исследования) в течение 12 нед. по ранее описанной методике [14]. В контрольную группу было включено 11 крыс, сопоставимых по массе и возрасту, которые в течение всего эксперимента находились на стандартном лабораторном корме со свободным доступом к пище и воде. Исследования были выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, одобрены Комиссией по контролю содержания и использования лабораторных животных (IACUC) ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (протокол № 1 от 25.04.2022 г.).

Спустя 12 нед. животных выводили из эксперимента СО2-эвтаназией. Выполняли забор крови из сердца, которую затем центрифугировали 10 мин при 2000 g для получения сыворотки. Извлекали и взвешивали висцеральную жировую ткань (мезентериальную, эпидидимальную и забрюшинную жировую клетчатку), фрагменты эпидидимальной жировой ткани замораживали в жидком азоте. Полученные аликвоты сыворотки крови и образцы жировой ткани хранили при температуре не выше –70 °С.

В сыворотке крови определяли концентрацию глюкозы (набор Glucose-TR, Chronolab, Испания), триацилгли-церолов, холестерола (наборы Триглицериды, Холестерин, Ольвекс Диагностикум, РФ), инсулина (Insulin Rat ELISA Kit, Thermo Fisher Scientifiс, США) и лептина (Rat Leptin ELISA Kit, ELK Biotechnology, КНР). Индекс HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance) рассчитывали как (сывороточный инсулин) × (сывороточная глюкоза) / 22,5.

Содержание АФК в эпидидимальной жировой ткани определяли по методу L. Liu и соавт. [15], для чего навески жировой ткани (50 мг) после размораживания переносили в буферный раствор (5 мМ HEPES в PBS, pH 7,4), содержащий 10 мкМ 2,3-дигидродихлорфлуоресцеина диацетат, и инкубировали 1 ч при 37 °С. После инкубации образцы ткани трижды промывали буферным раствором, затем добавляли 300 мкл лизирующего буфера (0,1% SDS, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4) и инкубировали 15 мин при 4 °С с последующим центрифугированием при 16000 g в течение 20 мин. Супернатант собирали и оценивали флуоресценцию при длине волны возбуждения 530 нм и длине волны испускания 485 нм с помощью микропланшет-ного ридера (Infinite 200 Pro M-plex, Tecan, Швейцария).

Для определения содержания восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона жировую ткань после размораживания (100 мг) гомогенизировали в 1,9 мл 5% раствора сульфосалициловой кислоты, затем центрифугировали при 15000 g (2–4 °C, 15 мин), собирали супернатант. Принцип метода определения основан на взаимодействии GSH с 5,5-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) (ДТНБ) с образованием тио-2-нитробензой-ной кислоты, имеющей максимум поглощения при длине волны 412 нм [16]. При этом образуется GSSG, который восстанавливается глутатионредуктазой, а GSH вновь взаимодействует с ДТНБ. Для определения GSSG пробы предварительно инкубировали с блокатором SH-групп – 2-винилпиридином. Расчет содержания общего глутатиона и GSSG производили с помощью калибровочных графиков для растворов GSН и GSSG (MP Biomedicals, США) в концентрациях от 0,1 до 150 нМ. Уровень GSН рассчитывали как разницу между концентрацией общего глутатиона и GSSG. Результаты представляли в нмоль/ мг белка.

Для измерения активности антиоксидантных ферментов готовили гомогенат из эпидидимальной жировой ткани в 0,05 М калий-фосфатном буфере, содержащем 1 мM ЭДТА, рН 7,5 (соотношение ткань: буфер составляло 1 : 3) при 2–4 °C. Полученные гомогенаты центрифугировали при 15000 г (2–4 °C, 15 мин), собирали супернатант. Активность глутатионредуктазы оценивали по кинетике изменения концентрации тио-2-нитробензойной кислоты в присутствии НАДФH2 на спектрофотометре СФ-2000 (Спектр, РФ) при длине волны 412 нм.

Глутатионпероксидазную активность определяли в сопряженной глутатионредуктазной системе по скорости окисления НАДФН2 при длине волны 340 нм с гидропероксидом трет-бутила в качестве субстрата. Активность глутатион-S-трансферазы оценивали по скорости реакции образования глутатион-S-конъюгатов между GSH и 1-хлор-2,4-динитробензолом при длине волны 340 нм. Активность ферментов выражали в нмоль/(мин*мг белка). Количественное определение белка выполняли в реакции с бицинхониновой кислотой (BCA Protein Assay Kit, Sigma-Aldrich, США).

Статистическую обработку результатов исследований проводили в программе SPSS STATISTICS 23 (IBM, США). Количественные данные, подчиняющиеся нормальному закону распределения, представлены в виде среднего (М) и стандартного отклонения (± SD ), неподчиняющиеся – в виде медианы ( Me ), 25-го и 75-го перцентилей ( Q 25; Q 75). Для анализа различий между выборками использовали t -критерия Стьюдента или U -критерия Манна – Уитни. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05. Для оценки взаимосвязи между показателями определяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Результаты

ВЖВУД, использованная в эксперименте для моделирования алиментарного МС у крыс, вызывала увеличение массы тела животных, удельной массы висцеральной жировой ткани. ВЖВУД способствовала повышению уровня глюкозы, инсулина и лептина в сыворотке крови крыс опытной группы (табл. 1). Корреляционный анализ показал сильную прямую корреляционную связь между содержанием глюкозы и инсулина в крови ( r = 0,814; p < 0,001). Величина индекса инсулинорезистентности HOMA-IR у крыс с диет-индуцированным МС статистически значимо превышала таковую у группы контроля. Увеличение концентрации лептина в крови животных опытной группы положительно коррелировало с уровнем глюкозы ( r = 0,839; p < 0,001), массой тела ( r = 0,560; p = 0,005) и массой абдоминального жира ( r = 0,475; p = 0,022). У крыс опытной группы также наблюдалось статистически значимое увеличение содержания триацилгли-церолов и холестерола в крови по сравнению с группой контроля (см. табл. 1).

Таблица 1. Показатели метаболического статуса крыс контрольной и опытной группы, M ± SD

Table 1. Parameters of the metabolic status of rats in the control and experimental groups, M ± SD

Параметры Parameters	Группа Group
	Контрольная ( n = 11) Control ( n = 11)	Опытная ( n = 12) Experimental ( n = 12)
Масса тела, г Body weight, g	435,5 ± 27,1	481,9 ± 36,6 ( р = 0,003)
Удельная масса жировой ткани, г Adipose tissue/ body weight ratio, g	2,4 ± 0,8	3,7 ± 0,9 ( р = 0,004)
Глюкоза, ммоль/л Glucose, mmol/l	5,5 ± 0,4	7,4 ± 0,8 ( р <  0,001)
Инсулин, пмоль/л Insulin, pmol/l	11,3 ± 1,9	22,2 ± 2,6 ( р <  0,001)
HOMA-IR	0,4 ± 0,1	1,1 ± 0,3 ( р = 0,002)
Лептин, нг/мл Leptin, ng/ml	2,2 ± 0,4	4,2 ± 0,4 ( р <  0,001)
Триацилглицеролы, ммоль/л Triacylglycerols, mmol/l	0,9 ± 0,2	1,6 ± 0,4 ( р = 0,001)
Холестерол, ммоль/л Cholesterol, mmol/l	1,8 ± 0,3	2,5 ± 0,6 ( р = 0,015)

Примечание: здесь и в таблице 2: р – различия по сравнению с контрольной группой. HOMA-IR – гомеостатическая модель оценки инсулинорезистентности.

Note: here and in table 2: р – significance vs. control group. HOMA-IR – Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance.

Уровень АФК в эпидидимальной жировой ткани крыс с диет-индуцированным МС в 1,4 раза (р = 0,007) превышал значение в контрольной группе животных (табл. 2).

Таблица 2. Содержание общего глутатиона, активность глутатион-за-висимых ферментов и уровень активных форм кислорода в жировой ткани крыс контрольной и опытной группы, Me ( Q ₂₅; Q ₇₅)

Table 2. Total glutathione content, activity of glutathione-dependent enzymes and level of reactive oxygen species in adipose tissue of rats in the control and experimental groups, Me ( Q ₂₅; Q ₇₅)

Параметры Parameters	Группа Group
	Контрольная ( n = 11) Control ( n = 11)	Опытная ( n = 12) Experimental ( n = 12)
GSH+GSSG, нмоль/мг белка GSH+GSSG, nmol/mg of protein	9,5 (8,1; 9,8)	6,4 (5,7; 7,4) р < 0,001
GSH/GSSG	24,9 (21,5; 28,0)	11,6 (9,2; 13,4) р < 0,001
Глутатионредуктаза, нмоль/(мин × мг белка) Glutathione reductase, nmol/(min × mg of protein)	31,9 (26,5; 35,5)	45,2 (41,1; 60,1) р < 0,001
Глутатионпероксидаза, нмоль/(мин × мг белка) Glutathione peroxidas, nmol/(min × mg of protein)	154,1 (143,1; 174,9)	139,4 (105,9; 151,6) р = 0,008
Глутатион-S-трансфераза, нмоль/(мин × мг белка) Glutathione-S-transferase, nmol/(min × mg of protein)	397,3 (293,3; 555,3)	227,9 (145,6; 291,1) р = 0,005

АФК, усл. ед.                                         2,4 (2,1; 2,6)

ROS, a.u.                           ^{1,8 (1,3; 2,2)} р = 0,007

Уровень общего глутатиона в жировой ткани крыс с экспериментальным МС статистически значимо снизился в 1,5 раза ( p < 0,001) по сравнению с аналогичным показателем у крыс контрольной группы (см. табл. 2), что главным образом было обусловлено снижением содержания восстановленной формы трипептида (рис. 2). При этом у животных опытной группы отмечалось статистически значимое повышение содержания окисленной формы глутатиона (рис. 3).

Рис. 2. Содержание воcстановленного глутатиона в эпидидимальной жировой ткани крыс контрольной и опытной группы, р – различия по сравнению с контрольной группой

Fig. 2. Concentration of reduced glutathione in the epididymal adipose tissue of control and experimental rats, р – significance to control group

Примечание: р – различия по сравнению с контрольной группой, АФК – активные формы кислорода, GSH+GSSG – общий глутатион, GSH/GSSG – отношение уровня восстановленного глутатиона (GSH) к окисленному глутатиону (GSSG).

Note: р – significance vs. control group, ROS – reactive oxygen species, GSH+GSSG – total glutathione, GSH/GSSG – reduced glutathione (GSH)/oxidized glutathione (GSSG) ratio.

Анализ показал наличие положительной прямой корреляционной связи между количеством продуцируемых АФК, концентрацией глюкозы ( r = 0,522; p = 0,002), лептина ( r = 0,553; p = 0,006) и удельной массой висцерального жира (рис. 1).

Удельная масса жировой ткани, г Adipose tissue/body weight ratio, g

Рис. 1. Зависимость уровня активных форм кислорода от удельной массы жировой ткани крыс контрольной и опытной группы; r – коэффициент корреляции Спирмена, р – различия по сравнению с контрольной группой

Fig. 1. Relationship of the level of reactive oxygen species with the adipose tissue/body weight ratio in rats of the control and experimental groups; r – Spearman’s correlation coefficient; р – significance vs. control group

Рис. 3. Содержание окисленного глутатиона в эпидидимальной жировой ткани крыс контрольной и опытной группы, р – различия по сравнению с контрольной группой

Fig. 3. Concentration of oxidized glutathione (GSSG) in the epididymal adipose tissue of control and experimental rats, р – significance vs. control group

Рис. 4. Зависимость уровня восстановленного глутатиона от удельной массы жировой ткани крыс контрольной и опытной группы. r – коэффициент корреляции Спирмена, р – различия по сравнению с контрольной группой

Fig. 4. Relationship of the level of reduced glutathione with the adipose tissue/body weight ratio in rats of the control and experimental groups. r – Spearman’s correlation coefficient, р – significance vs. control group

Соотношение GSH/GSSG также статистически значимо снижалось у животных с экспериментальным МС (см. табл. 2). Установлено, что между концентрацией GSH в жировой ткани и ее удельной массой наблюдалась от- рицательная корреляция (рис. 4), тогда как между содержанием GSSG и удельной массой жировой ткани существует положительная взаимосвязь (r = 0,573; p = 0,001).

При этом содержание общего глутатиона эпидидимальной жировой ткани отрицательно коррелировало ( r = –0,477; p = 0,005) с концентрацией в ней АФК. Развитие метаболических нарушений при ВЖВУД приводило к снижению активности глутатион-зависимых ферментов антиоксидантной защиты глутатионпероксидазы и глута-тион-S-трансферазы (см. табл. 2) в клетках жировой ткани крыс, но, напротив, вызывало повышение глутатион-редуктазной активности.

Обсуждение

Патогенез МС представляет собой сложную систему взаимодействующих факторов, характеризующих нарушения обменных процессов и внутриклеточного гомеостаза на фоне пониженной чувствительности тканей к инсулину [1, 7]. Висцеральное ожирение как один из компонентов МС является триггером для возникновения множества системных метаболических нарушений, опосредующих нейроиммуноэндокринную дисфункцию на системном уровне [4–6].

Современные исследования показывают, что гипертрофия адипоцитов тесно связана с развитием резистентности к инсулину, хроническим воспалением и окислительным стрессом [6, 9]. Отличительным признаком дисфункции адипоцитов является неспособность клеток накапливать избыток нутриентов в виде внутриклеточных липидов, что приводит к повышению концентрации триацилглицеролов и свободных жирных кислот в крови и сопровождается эктопическим накоплением жиров, например, в печени, скелетных мышцах, поджелудочной железе и миокарде.

На этом фоне в организме реализуются системные липотоксические эффекты, а жировая ткань приобретает провоспалительный функциональный статус вследствие нарушения процессов регуляции секреции адипокинов (гормонов лептина, адипонектина, резистина и др.) и адипоцитокинов (IL-6, IL-8, TNFα, хемокина CCL2, IL-10) [1, 2]. Так, при ожирении уровень лептина, который секретируется почти исключительно адипоцитами, значительно повышается [4], что может провоцировать возникновение окислительного стресса через стимуляцию окисления жирных кислот в митохондриях [6], активацию НАДФН-оксидазы (NOX) и индукцию продукции перекиси водорода (H2O2) и гидроксильных радикалов [10], а также стимулировать активацию моноцитов и макрофагов в жировой ткани [4].

Повышение продукции АФК в жировой ткани является одной из характеристик нарушения функции адипоцитов при их гипертрофии, способствует нарушению окислительно-восстановительного баланса и является одним из факторов формирования инсулинорезистентности [7, 8]. Вместе с тем показано, что значительное возрастание интенсивности наработки АФК в адипоцитах крыс, находившихся на диете с высоким содержанием сахарозы более 15 нед., было тесно связано с развитием гипергликемии [4].

Примечательно, что адипоциты, по-видимому, адаптируются к динамическим изменениям уровней АФК и используют их в качестве вторичных мессенджеров. Было обнаружено, что H2O2 имитирует действие инсулина: воздействие H2O2 на адипоциты приводило к быстрой транслокации переносчиков глюкозы и увеличению поглощения глюкозы, усилению синтеза липидов [8]. Однако избыток АФК провоцирует окислительное повреждение молекулярных компонентов клеток, что приводит к перекисному окислению липидов и/или карбонилированию белков [17, 18]. Окислительная модификация белков преимущественно происходит путем прямого окисления аминокислот пролина, треонина, лизина и аргинина. Результаты исследований свидетельствуют о том, что окислительный стресс приводит к интенсивному окислению и карбонилированию многочисленных белков, опосредующих дисфункцию жировой ткани, включая FABP4 или GLUT4, что, вероятно, вызывает утрату их функциональной активности [17].

В реализованной нами модели МС убедительно показано, что ВЖВУД приводит к изменению физиологических и биохимических показателей, что находит свое отражение в избыточном накоплении жировой ткани, гипергликемии, инсулинемии, инсулинорезистентности, дислипидемии, лептинемии у животных экспериментальной группы. При этом, как нами установлено, повышение удельной массы жировой ткани взаимосвязано с увеличением концентрации глюкозы, лептина в сыворотке крови и уровня АФК в эпидидимальной жировой ткани животных с МС. Полученные результаты соотносятся с данными литературных источников, что служит подтверждением эффективности ВЖВУД для создания животных моделей МС [4, 9], а также подтверждает ее состоятельность для оценки про- и антиоксидантной активности жировой ткани.

Окислительный стресс, возникающий в жировой ткани, может быть обусловлен не только повышением продукции АФК, но и снижением антиоксидантной защиты адипоцитов. Так, у крыс, получавших высокоуглеводный корм, было зафиксировано снижение активности супе-роксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глу-татионредуктазы, начиная с 3-й нед. эксперимента [4]. В клинических исследованиях было установлено, что экспрессия глутатионпероксидазы была значительно ниже в жировой ткани пациентов с сахарным диабетом 2-го типа по сравнению со здоровыми добровольцами [12]. Отмечается, что в жировой ткани мышей, содержавшихся на ВЖВУД, концентрация фермента глутатион-S-транс-феразы, участвующего в метаболизме прооксидантного альдегида 4-HNE, была снижена примерно в 3–4 раза вследствие карбонилирования [18].

Наряду с антиоксидантными ферментами важную роль в нейтрализации эндогенных АФК выполняет трипептид GSH [11, 19]. Антиоксидантная функция GSH в основном реализуется за счет реакций, катализируемых глутатионпероксидазой, которая восстанавливают H2O2 и гидроперекиси липидов по мере того, как GSH окисляется до GSSG, последний в свою очередь восстанавливается обратно до GSH глутатионредуктазой за счет НАДФН. Таким образом, важным показателем внутриклеточного редокс-баланса является отношение GSH к GSSG. При окислительном стрессе нарушается способность клеток восстанавливать GSSG до GSH, что приводит к накоплению GSSG и истощению запасов GSH [19].

В нашем исследовании было также установлено, что уровень общего глутатиона в жировой ткани крыс с ожирением снизился главным образом за счет уменьшения содержания GSH. Баланс GSH/GSSG сместился в сторону преобладания окисленной формы трипептида. Причем содержание общего глутатиона уменьшилось пропорционально увеличению уровня АФК в жировой ткани крыс, содержавшихся в течение 12 нед. на ВЖВУД. Кроме того, у животных опытной группы отмечалось снижение активности глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансфера-зы, но повышение глутатионредуктазной активности.

Подобное изменение редокс-баланса при МС может свидетельствовать о дисфункции и недостаточности нейтрализующего действия системы глутатиона при образующемся избытке АФК. Однако, несмотря на то, что большинство экспериментальных данных указывает на угнетение активности глутатион-зависимой антиоксидантной ферментативной системы, существуют сведения, что снижение функции глутатионпероксидазы и повышение экспрессии гамма-глутамилцистеин-синтетазы приводили к избыточному накоплению GSH в изолированных 3T3-L1 адипоцитах [20]. Равно как и у трансгенных мышей с гиперэкспрессией глутатионпероксидазы, отмечалось снижение чувствительности адипоцитов к инсулину [11].

Неоднозначность описанных в научной литературе эффектов антиоксидантных ферментов создает предпосылки для дальнейшего изучения их активности в различных тканях на фоне нарушений обмена веществ, характерных для данного синдрома.

Заключение

Ожирение как ключевой компонент МС является триггером для формирования инсулинорезистентности, хронического вялотекущего воспаления с системными проявлениями, в том числе за счет реакций окислительного стресса. В экспериментальной модели МС было исследовано функциональное состояние глутатион-зависимой антиоксидантной системы и ее роль в формировании метаболической дисфункции жировой ткани.

Установлено, что формирование МС и избыточное накопление висцерального жира у крыс на фоне ВЖВУД приводит к сдвигу окислительно-восстановительного баланса адипоцитов в сторону усиления их прооксидантной активности в совокупности с угнетением глутатион-зави-симой антиоксидантной системы. Учитывая высокую распространенность МС и возможные осложнения, необходимо углубленное изучение его патогенеза на клеточном и молекулярном уровнях с целью совершенствования способов профилактики и тактики лечения системных заболеваний, ассоциированных с кардиометаболическим риском.