Габитус и продуктивность люцерны (Medicago sativa L.) в зависимости от инокуляции штаммами Sinorhizobium meliloti, различающимися по солеустойчивости

Симбиотическая эффективность (СЭ), или способность увеличивать продуктивность (массу, накопление азота, количество семян) у бобо-

Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 14-26-00094.

вых растений-хозяев, — важнейший признак клубеньковых бактерий (ризобий), характеризующий их адаптивный потенциал и практическую значимость (1, 2). Этот признак определяется в первую очередь фиксацией молекулярного азота (N2), которая осуществляется ризобиями в корневых клубеньках и контролируется генотипами обоих партнеров (3). Однако генетические механизмы контроля СЭ до сих пор остаются малоизученными.

Наибольшая интенсивность N₂-фиксации характерна для быстрорастущих ризобий (Rhizobium, Sinorhizobium), которые в условиях симбиоза способны к трансформации в нежизнеспособные внутриклеточные бактероиды. Их высокая ^-фиксирующая активность достигается благодаря необратимому ингибированию клеточных функций, необходимых для автономного существования, включая ряд стадий азотно-углеродного обмена и биогенеза клеточных структур (4).

Известно, что СЭ определяется многими генными системами ризобий, в том числе не связанными с работой нитрогеназы (фермента, катализирующего восстановление N2 в NH3), поэтому следует рассматривать ^-фиксирующую активность и СЭ как два разных симбиотических признака (2).

Так, анализ Тн5-мутантов ризобий люцерны (Sinorhizobium meli-loti), обладающих повышенной СЭ (5), выявил серию негативных регуляторов симбиоза ( ef -генов), ни один из которых не входит в состав nif и //т -оперонов, кодирующих структуру нитрогеназы, активацию ее синтеза и снабжение энергией (6). Функциональная связь с N₂-фиксацией выявлена лишь для некоторых ef -генов, например для гена phbA, инактивация которого нарушает синтез предшественника поли- в -гидроксибутирата (ацето-ацетил-КоА), увеличивая количество углерода, направляемого бактериальной клеткой на энергоснабжение нитрогеназы (7).

Ризобии способны синтезировать множество биологически активных веществ, которые влияют на развитие растений-хозяев: фитогормоны (8-10), витамины (11-12), люмихром (14-15). Липохитоолигосахаридные Nod-факторы, с помощью которых ризобии активируют развитие клубеньков, резко изменяют синтез растениями фитогормонов, повышая соотношение цитокининов к ауксинам в корнях, в результате чего активируется деление клеток кортекса и перицикла, приводящее к закладке клубеньковых примордиев (16). Модификации гормонального статуса бобовых, вызываемые ризобиями, могут изменять соотношения ключевых морфометрических параметров надземных и подземных органов (габитус растений), связанных с СЭ (17).

Ранее мы установили, что у однолетней диплоидной люцерны (Medicago truncatula) под действием солевого стресса резко уменьшается длина побегов (в 3-14 раза) при сохранении их массы (18). У некоторых линий M. truncatula габитус нормализуется при инокуляции N₂-фикси-рующими штаммами Sinorhizobium meliloti, что подтверждает сходство механизмов развития симбиоза и реакции растений на солевой стресс. Логично предположить, что регуляторные воздействия микросимбионтов на растения будут наиболее выраженными на фоне влияния генотипических или средовых факторов, снижающих интенсивность N₂-фиксации.

В настоящей работе мы впервые показали, что проявление СЭ ризобий зависит от факторов двух типов — трофических (определяются интенсивностью симбиотической N2-фиксации) и регуляторных (предположительно связаны с модификациями гормонального статуса растений, влияющими на активность корневых и побеговых меристем).

Целью нашей работы было изучение влияния активно фиксирую- щих N2, но контрастно различающихся по солеустойчивости штаммов ри-зобий Sinorhizobium meliloti на показатели габитуса и продуктивности у многолетней тетраплоидной люцерны (Medicago sativa L.) при действии солевого стресса, а также при мутациях микросимбионтов, снижающих симбиотическую эффективность.

Методика. В работе использовали активно фиксирующие N 2 штаммы клубеньковых бактерий люцерны: 1021 — стандартный лабораторный штамм (19), СХМ1-188 — УФ-индуцированный мутант штамма СХМ1, обладающий повышенной СЭ (20), и СА67 — штамм, выделенный из почвы в Таджикистане (21). Кроме того, исследовали Тп5-индуцированные мутанты — F (получен от штамма СА67 в настоящей работе) и GL1 (получен от штамма 1021 в университете г. Дальхаус, Канада). Солеустойчи-вость штаммов определяли на плотной (1,5 % агар-агара) среде TY с разными концентрациями NaCl (от 2,0 до 4,5 %).

Семена люцерны посевной сорта Агния, устойчивого к эдафиче-ским стрессам, получены во Всероссийском НИИ кормов им. В.Р. Вильямса (Московская обл., г. Лобня).

Бобово-ризобиальный симбиоз изучали в микровегетационных опытах при выращивании растений в стерильных пробирках на агаризо-ванной (0,7 %) безазотной среде Красильникова-Кореняко в 8-10-кратной повторности в течение 30 сут (20). Показателем СЭ служила прибавка сухой массы побегов у инокулированных ризобиями растений по сравнению с контрольными (неинокулированными).

Для анализа действия солевого стресса на показатели развития (длина побегов, длина корней, сухая масса корней) растений люцерны их выращивали в среде с добавлением 0,6 % NaCl.

Статистическую обработку данных проводили посредством дисперсионного анализа (22) в программе Microsoft Office Excel 2007.

Результаты. Штаммы, использованные в работе, контрастно различались по устойчивости к солевому стрессу: 1021 и СХМ1-188 были способны расти на твердой агаризованной среде 79 при добавлении 3 % NaCl (R-фенотип), тогда как рост штамма СА67 на этой среде оказался подавлен (S-фенотип). Тп5-индуцированные мутанты проявляли пониженную СЭ (фенотип Eff^+/-), причем мутант F штамма СА67 обладал также повышенной солеустойчивостью (был способен расти в присутствии 3,5 % NaCl).

При симбиозе с люцерной в отсутствие солевого стресса наибольшую СЭ проявил S-штамм СА67: у инокулированных им растений масса и длина побегов повышались соответственно на 163 и 169 % по сравнению с контролем, тогда как длина корней несущественно (на 7 %) снижалась (табл. 1).

1. Относительные изменения (%) показателей развития у растений люцерны Medicago sativa L., инокулированных штаммами ризобий Sinorhizobium meliloti, различающимися по солеустойчивости (микровегетационный опыт)

Штамм	Без солевого стресса	В условиях солевого стресса (0,6 % NaCl)
	МП | ДП | ДК	МП 1 ДП 1 ДК

СА67 (S)	+ 163*	+169*	- 7	+5	+36*	+79*
1021 (R)	+73*	+90*	- 28*	+138*	- 1	- 7
СХМ1-188 (R)	+96*	+56*	- 21*	+160*	- 24*	- 6

Примечание. В скобках указана способность штаммов к росту на среде с 3 % NaCl: R — наличие, S — отсутствие роста. МП — сухая масса побегов, ДП — длина побегов, ДК — длина корней.

*P q < 0,05 (достоверное отличие от контроля без инокуляции).

Инокуляция R-штаммами СХМ1-188 и 1021 повышала массу и длину побегов на 56-96 %, а длина корней достоверно снижалась (на 2128 %). При этом наблюдались резкие изменения габитуса люцерны: соотношение длины побегов и корней возрастало в 2-3 раза по сравнению с контролем без инокуляции (рис.).

Вариант

Соотношение длины побегов и корней (ДП/ДК) у люцерны Medicago sativa L. в отсутствие (1) и при действии солевого стресса (0,6 % NaCl) (2) при инокуляции различными штаммами Sinorhizobium meliloti. а — КБИ (контроль без инокуляции), б — СХМ1-188, в — 1021, г — СА67 (микровегетацион-ный опыт).

Действие солевого стресса (0,6 % NaCl) приводило к утрате СЭ у S-штамма СА67: масса побегов не изменялась по сравнению с контролем, хотя их длина достоверно возрастала на 36 % (см. табл. 1). Длина корней увеличивалась на 79 %, что могло быть связано с преимущественной стимуляцией бактериями развития корневых меристем. СЭ у R-штаммов в условиях солевого стресса оказалась более высокой, чем без него: масса побегов возрастала на 138-160 % по сравнению с контролем, однако их длина достоверно уменьшалась (для штамма СХМ1-188), либо оставалась прежней (для штамма 1021). При этом наблюдалось недостоверное (на 6-7 %) снижение длины корней, поэтому габитус растений изменялся незначительно (см. рис.).

Поскольку в условиях стресса длина побегов и корней возрастала только при инокуляции люцерны S-штаммом СА67, логично предположить, что оптимальные условия для ростстимулирующего воздействия бактерий на растения создавались именно при подавлении СЭ. Однако у низкоэффективного (Eff+/—) мутанта F, несмотря на его повышенную со-леустойчивость, воздействие на габитус растений оказалось таким же, как у родительского штамма CF67 (табл. 2).

2. Симбиотическая эффективность мутантного (F) и родительского (СА67) штаммов Sinorhizobium meliloti на растениях люцерны Medicago sativa L. в зависимости от действия солевого стресса (микровегетационные опыты)

Инокулюм

МП, мг

ДП, мм

ДК, мм

Габитус растений ДП/ДК 1 МП/ДП

Без солевого стресса

СА67	23,7а	86,1a	195,3a	0,44a	0,28a
F	17,3b	64,3a	140,1b	0,46a	0,27a
Отсутствует	9,0c	32,5b	210,9с	0,15b	0,28a
НСР 0,05	4,85	23,27	15,53	0,08
	В	условиях солевого	стресса	(0,6 % NaCl)
СА67	9,8c	15,2c	75,5c	0,20a	0,65a
F	8,0c	15,3c	64,7c	0,23a	0,52b
Отсутствует	9,3c	11,0d	42,8d	0,26a	0,85c
НСР 0 05	1,94	2,08	15,73	0,07

Примечание. МП — масса побегов, ДП — длина побегов, ДК — длина корней. Разными буквами (a, b, c, d) обозначены достоверно (P o < 0,05) различающиеся значения для каждого признака.

Не было выявлено изменений габитуса растений и у Eff+/- мутанта штамма GL1, не отличающегося по солеустойчивости от родительского штамма 1021 (табл. 3).

Влияние инокуляции клубеньковыми бактериями на габитус люцерны (соотношение длины побегов и корней) проявлялось только в отсутствие солевого стресса. При стрессе этот показатель практически не менялся, однако соотношение массы побегов к их длине возрастало с 0,16346

0,34 до 0,52-0,68 мг/мм (см. табл. 2 и 3). Аналогичное изменение габитуса мы наблюдали ранее при воздействии солевого стресса на инокулированные ризобиями растения диплоидной люцерны M. truncatula (18). Поскольку количество клубеньков при солевом стрессе достоверно не меняется, очевидно, что у обоих видов люцерны активность побеговых меристем подавляется в большей степени, чем активность клубеньковых меристем (18).

3. Симбиотическая эффективность мутантного (GL1) и родительского (1021) штаммов Sinorhizobium meliloti на растениях люцерны Medicago sativa L. в зависимости от действия солевого стресса (микровегетационный опыт)

Инокулюм	МП, мг	МК, мг	ДП, мм	ДК, мм	Габитус растений
					МП/МК |	ДП/ДК | МП/ДП
1021	17,9a	Бе 4,3a	з со лев о г 53,1a	о стресс 129,6a	а 4,16a	0,40a	0,34a
GL1	10,5b	2,4b	65,6a	145,5a	4,38a	0,45a	0,16b
Отсутствует	7,5bd	6,5c	27,9b	181,1b	1,15b	0,15b	0,27a
1021	В 10,7b	условиях солевого стресса (0,6 % NaCl) 5,0a           20,7b         145,2a        2,14c				0,14b	0,52c
GL1	10,4b	5,3a	15,2c	151,8a	1,96c	0,10b	0,68d
Отсутствует	4,5cd	7,3c	20,8b	156,0a	0,61b	0,13b	0,22ab
НСР 0 05	4,23	1,27	5,11	32,54	0,97	0,08

Примечание. МП — масса побегов, МК — масса корней, ДП — длина побегов, ДК — длина корней. Разными буквами (a, b, c, d) обозначены достоверно (P o < 0,05) различающиеся значения для каждого признака.

Логично предположить, что увеличение длины побегов в сочетании с укорочением корней, которое мы наблюдали при инокуляции люцерны ризобиями в отсутствие стресса, улучшало усвоение фиксированного азота, способствуя его транслокации в надземные органы и использованию для развития вегетативной массы и семян. Удлинение побегов и укорочение корней могли быть обусловлены выявленной ранее (16) выработкой ризобиями ингибиторов синтеза ауксинов, которая приводила к снижению соотношения ауксины:цитокинины, стимулируя развитие меристем побегов и клубеньков (сходных по тканевой структуре с побегами), но ингибировала активность корневых меристем. Действительно, у ризобий сои (Bradyrhizobium japonicum) интенсивность синтеза цитокининов коррелирует с числом образуемых клубеньков и с СЭ (23). Выявленное нами возрастание длин корней и побегов у M. sativa при инокуляции S-штаммом СА67 в условиях стресса могло быть обусловлено тем, что при подавлении нитрогеназной активности усиливался синтез фитогормонов, который осуществляют либо бактерии, либо растительные клетки, подвергшиеся воздействию бактериальных сигналов (16, 25).

Описанные нами эффекты, возможно, были обусловлены системной регуляцией клубенькообразования, которая у модельного бобового Lotus japonicus L. начинается с индукции бактериями синтеза сигнальных CLE-пептидов в корнях (16). Воздействие CLE-пептидов на рецепторную киназу HAR1, синтезируемую в побегах, вызывало продукцию ответных сигналов, которые перемещались в корни и блокировали формирование избытка клубеньков. При этом в надземной части растений активировался синтез цитокининов (под контролем белка LjIPT3), которые повышали активность побеговых меристем, но снижали активность меристем корня (24).

Модификации габитуса у растений M. sativa, наблюдаемые нами при сочетании солевого стресса и инокуляции чувствительным к нему штаммом S. meliloti СА67, могли быть связаны с различной направленностью изменений гормонального статуса, вызываемых этими воздействиями в надземных и подземных органах. Известно, что нарушения синтеза фитогормонов, выявленные у сои (26) и у ряда небобовых растений (27) при солевом стрессе, носят сложный характер: они включают изменения со- держания салициловой и жасмоновой кислот, участвующих в реакции растений на инокуляцию фитопатогенными и симбиотическими микроорганизмами. Эти изменения могут отражать эволюционную связь ризобий с ризосферными и эндофитными симбионтами, ростстимулирующая активность которых обусловлена главным образом синтезом фитогормонов (28, 29).

Таким образом, анализ изменений габитуса растений люцерны Medicago sativa при инокуляции штаммами ризобий Sinorhizobium meliloti и под действием солевого стресса показал, что эффективность бобово-ризобиального симбиоза зависит не только от интенсивности ^-фиксации, но и от регуляторных воздействий микросимбионтов, которые определяют гормональный статус растений-хозяев. Логично предположить, что в системе клубенькового симбиоза регуляторные воздействия ризобий на бобовые растения существенно активируют их симбиотрофное развитие (например, улучшая ассимиляцию продуктов N₂-фиксации активно растущими надземными органами). Гены, контролирующие эти воздействия, могут быть использованы для конструирования штаммов ризобий с повышенной симбиотической эффективностью, которая определяется активностью усвоения бобовыми фиксированного азота, а также их устойчивостью к эдафическим стрессам.

Авторы признательны Л.А. Луговой за критические замечания по статье и СН. Юргель, предоставившей мутант GL1.