Галофильный штамм-деструктор бензойной кислоты Halomonas sp. D2

способные осуществлять разложение бензойной кислоты и использовать ее в качестве единственного источника углерода и энергии [Field, Sierra-Alvarez, 2008; Егорова, Пьянкова, 2019]. В то же время крайне ограничена информация о галофиль-ных бактериях-деструкторах, строении и функционировании их метаболических, генетических систем, контролирующих разложение бензойной кислоты в условиях засоления [Fathepure, 2014].

Ранее из соляной шахты района промышленных разработок Верхнекамского месторождения калийно-магниевых солей (ВМКС) были выделены галофильные бактерии, которые на основании морфологических, физиологических и генетических исследований были идентифицированы как представители семейства Halomonadaceae (класс Gammaproteobacteria ) [Пьянкова и др., 2020]. На настоящем этапе изучения проводится дальнейшая характеристика выделенных галофилов, в том числе для перспективы использования в биотехнологических целях. Цель настоящей работы – изучение способности галофильного штамма Halomonas sp. D2 разлагать бензойную кислоту в условиях повышенной солености среды, а также выявление и филогенетическая характеристика ключевого гена катаболизма бензойной кислоты ( benA ).

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлся штамм Halomonas sp. D2, выделенный из глинистых донных отложений рассолоотводящей выработки одного из рудников ВМКС [Пьянкова и др., 2020]. Также в работе был использован типовой штамм Halomonas taeanensis BH539^T из рабочей коллекции лаборатории микробиологии техногенных экосистем «ИЭГМ УрО РАН».

Среды и условия культивирования. При культивировании бактерий использовали минеральную среду Раймонда (МСР) [Raymond, 1961], а также богатую среду Раймонда (БСР) с триптоном (5 г/л) и дрожжевым экстрактом (2.5 г/л), с разным содержанием NaCl (от 10 до 300 г/л). Для агаризованных сред добавляли 15 г/л агара. Культивирование проводили при 28 °С.

Устойчивость бактерий к различным концентрациям хлорида натрия оценивали по появлению и размеру колоний при росте на агаризо-ванной БСР без соли и с содержанием NaCl от 10 до 300 г/л. Оценку роста колоний проводили через 2 недели после культивирования.

Рост бактерий на ароматических соединениях оценивали при культивировании в жидкой минеральной среде Раймонда (30 г/л NaCl). Бензойную кислоту, нафталин, бифенил, орто-фталат, как единственный источник углерода и энергии, добавляли в среду в количестве 1 г/л, салициловую кислоту – 0.5 г/л. Культивирование проводили на термошейкере при 28°С при 140 об./мин. Рост штаммов оценивали при определении оптической плотности культуры (ОП600) на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при длине волны 600 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см.

Ростовые характеристики штамма D2 определяли при выращивании в жидкой МСР с бензойной кислотой (1 г/л) и содержанием 30 г/л NaCl, оптимальным для роста культуры. Культивирование проводили на термошейкере при 28°С при 140 об./мин. в течение 2 недель. Рост штаммов оценивали при определении оптической плотности культуры (ОП 600 ). Параметры роста культуры рассчитывали согласно Г. Шлегеля [1987]. Эксперименты были выполнены в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel.

Выделение бактериальной ДНК. Единичную колонию чистой культуры бактерий при помощи платиновой петли помещали в пробирку «эппен-дорф», содержащую 100 мкл 0.05 NaOH. Смесь инкубировали при 95°C в течение 15 мин., затем охлаждали 15 мин. при температуре -20°C, далее центрифугировали при 12 000 об./мин. 30 сек. Процедуру повторяли 4 раза. Для проведения ам-плифкации отбирали 1 мкл супернатанта.

Амплификация и определение нуклеотидных последовательностей гена benA . Для амплификации гена benA , кодирующего α-субъединицу бензоат 1,2-диоксигеназы, использовали праймеры benA-F (5’-GCCCACGAGAGCCAGATTCCC-3’) и benA-R (5’-GGTGGCGGCGTAGTTCCAGTG-3’) при условиях, приведенных в публикации [Baggi et al., 2008]. Амплификацию осуществляли на приборе C1000 TouchTM Thermal Cycler («Bio-Rad Laboratories», США). В качестве положительного контроля был использован штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, деструктор бензойной кислоты [Егорова и др., 2013]. Анализ продуктов амплификации и документирование полученных результатов осуществляли, как описано ранее [Пьянкова и др., 2020].

Определение нуклеотидных последовательностей гена benA проводили на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3500xl («Applied Biosystems», США), с применением реактивов Big Dye Terminator Ready Reaction Kit v 3.1 («Applied Biosystems», США), согласно рекомендациям производителя, на кафедре ботаники и генетики растений Пермского государственного национального исследовательского университета. Поиск гомоло- гичных последовательностей гена benA осуществляли с использованием базы данных GenBank . Множественное выравнивание транслированных аминокислотных последовательностей гена benA и построение филогенетического дерева проводили с использованием программы MEGA 7.0. При построении филогенетического дерева применяли кластерный метод «neighbor-joining». Оценку статистической достоверности ветвления («bootstrap»-анализ) устанавливали на основе 1000 альтернативных деревьев. Нуклеотидная последовательность гена benA депонирована в базу данных GenBank под номером MW862487.

Результаты и их обсуждение

Ранее из образца глинистых отложений соляной шахты ВКМС был выделен грамотрицательный штамм D2. В результате секвенирования и сравнения последовательностей гена 16S рРНК с типовыми штаммами из базы данных EzBioCloud было установлено, что данный штамм относится к се- мейству Halomonadaceae (класс Gammaproteobacteria) и имеет наибольшее сходство (99.43% по гену 16S рРНК) с типовым штаммом Halomonas taeanensis BH539T [Пьянкова и др., 2020].

Проведенные исследования по изучению дегра-дационных свойств штамма D2 показали, что он способен использовать в качестве единственного источника углерода и энергии бензойную кислоту, но не другие моно- и полиароматические соединения (в частности, салициловую, орто -фталевую кислоты, нафталин, бифенил).

Установлено, что штамм Halomonas sp. D2 является галофильным организмом и способен к эффективному росту в БСР при содержании хлорида натрия от 10 до 300 г/л. В сравнении, штамм Halomonas taeanensis BH539^T выдерживал не более 250 г/л NaCl при культивировании в аналогичных условиях. Оба штамма не росли при отсутствии соли в среде. В МСР с использованием в качестве субстрата бензойной кислоты (1 г/л) штаммы Halomonas sp. D2 и H. taeanensis BH539^T росли в присутствии 10‒70 г/л соли (табл. 1).

Таблица 1

Рост бактерий рода Halomonas в присутствии различных концентраций хлорида натрия

Штамм	Агаризованная БСР, NaCl (г/л)							Жидкая МСР, бензойная кислота (1 г/л), NaCl (г/л)
	Без NaCl	10	100	150	200	250	300	Без NaCl	30	50	70
H. taeanensis DSM 16463T	–	+	+	+	+	+	–	–	+++	++	+
Halomonas sp. D2	–	+	+	+	+	+	+	–	+++	+++	++

Примечание. «–» – рост не обнаружен; «+» – на агаризованной среде, колонии размеров больше 2 мм; «+» – в жидкой среде, ОП 600 от 0.1 до 0.3 ед.; «++» – ОП 600 от 0.4 до 0.7 ед.; «+++» – ОП 600 выше 0.7 ед.

Штамм D2 демонстрировал наибольший прирост биомассы при выращивании на бензоате в присутствии 30 г/л NaCl. На рисунке 1 представлена кривая роста штамма D2. На начальных этапах культивирования наблюдался замедленный рост культуры (ОП600 не превышала 0.2 ед.), толь- ко через 150 ч. был отмечен активный прирост биомассы. Максимальная ОП600, равная 1.05 ед., наблюдалась при 259 ч. (11-е сут.) культивирования. Скорость экспоненциального роста (µ) составляла 0.0211±0.003 ч–1.

Рис. 1 . Рост штамма Halomonas sp. D2 в МСР (30 г/л NaCl) на бензойной кислоте (1 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии

На ДНК-матрице штамма D2 был амплифици-рован ген benA, кодирующий α-субъединицу бен- зоат 1,2-диоксигеназы – ключевого фермента, участвующего на начальном этапе окислении бен- зоата [Parales, Resnick, 2006]. Также фрагмент аналогичного размера (около 521 п.н.) был обнаружен в ДНК штамма H. taeanensis BH539T, что указывает на присутствие гена benA в ДНК типового штамма (рис. 2).

М 1 2 К+К-

Рис. 2 . Электрофореграмма результатов амплификации гена benA :

M – маркер 100+ bp DNA Ladder (Евроген, Россия), 1 – Halomonas sp. D2, 2 – H. taeanensis BH539 ^T , K+ – Rhodococcus wratislaviensis

КТ112-7, K- – отрицательный контроль

Полученный ампликон гена benA Halomonas sp. D2 был секвенирован. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена benA штамма Halomonas sp. D2 с гомологичными последовательностями из базы данных GenBank (табл. 1). Установлено, что наиболее близким к изучаемому гену является ген α-субъединицы бензоат/толуат-1,2-диоксигеназы типового штамма H. taeanensis BH539^T (FNCI01000003). Сходство гена benA штамма Halomonas sp. D2 c гомологичным геном H. taeanensis BH539^T составляло 94.86%. С другими подобными генами представителей рода Halomonas уровень сходства не превышал 89.38%, а с генами штаммов других родов семейства Halomonadaceaе – 78.13% (ближайшая последовательность гена benA Chromohalobacter sp. HS2, EU155151) (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительный анализ гена benA штамма Halomonas sp. D2 с ближайшими гомологичными последовательностями из базы данных GenBank

Гомологичные гены	Номер в GenBank*	Номер в GenBank**	Сходство, %	Место выделения	Ссылка
Бензоат/толуат 1,2-ДО, H. taeanensis BH539T	FNCI01000003	SDF94072	94.86	Солнечная солеварня, Корея	н.д.
Бензоат 1,2-ДО, H. aestuarii Hb3	CP018139	APE30514	89.38	Солеварня, Корея	н.д.
Белок с кластером Риске [2Fe-2S], Halomonas sp. BM-2019	CP071922	QTF93273	87.90	Озерная вода, Танзания	н.д.
Бензоат 1,2-ДО, H. beime-nensis NTU-111	CP021435	ATJ82503	87.50	Солеварня, Тайвань	Chen et al., 2017
Бензоат 1,2-ДО, H. organivorans CECT 5995T	FN997646	CBR26855	86.74	Засоленная почва, Испания	García et al., 2004
Белок с кластером Риске [2Fe-2S], Halomonas sp. PGE1	CP053032	QJQ97940	86.70	Гиперсоленая экосистема, Нидерланды	н.д.
Бензоат 1,2-ДО, Chromo-halobacter sp. HS2	EU155151	ABV82781	78.13	Солёные ферментированные моллюски	Kim et al., 2008

Примечание: «н.д.» – нет данных; * – нуклеотидные последовательности; ** – аминокислотные последователь- ности.

На основании полученных данных построено филогенетическое дерево, показывающее положение транслированных аминокислотных последовательностей benA штамма Halomonas sp. D2 и гомологичных последовательностей представителей семейства Halomonadaceaе (рис. 3).

Гены benA, кодирующие большую субъединицу ключевого фермента деструкции БК – бензоат 1,2-диоксигеназы, выявлены в геномах бактерий различных таксономических групп [Егорова, Пьянкова, 2019]. На настоящем этапе исследований пока- зано, что ген benA штамма Halomonas sp. D2 является наиболее филогенетически близким benA-генам галофильных бактерий-деструкторов бензоата, рода Halomonas (сем. Halomonadaceae) и, кроме того, имеет высокий процент сходства (94.86%) с benA-геном типового штамма вида H. taeanensis, который является наиболее близкородственным по гену 16S рРНК штамму D2 [Пьянкова и др., 2020]. Таким образом, мы предполагаем, что benA-ген может быть использован в качестве филогенетического маркера для определения бакте- рий рода Halomonas среди деструкторов БК раз- личных таксонов прокариот.

- Бензоат 1,2-ДО, Halonwnas sp. D2 (MW862487)

Бензоат/толуат 1.2-ДО.Я kiwmensis BH539^T(SDF94072)

------Бензоат 1.2-ДО.//, aestitarii НЬЗ(АРЕЗО514)

--------Бензоат 1.2-ДО, Н. beimenensisYTO-X 11 (ATJ82503)

-----------Белок с кластером Риске. HalomoiMs sp. ВМ-2019 (QTF93273)

----------Белок с кластером Риске. Halomonas sp. PGE1 (QJQ97940) Бензоат 1.2-ДО. //. organivomns СЕСТ 5995^T(CBR26855)

------------Бензоат 1.2-ДО. Chromohalobacter sp HS2 (ABV82781)

।----------------------------------1

Ml

Рис. 3 . Филогенетическое дерево, построенное с использованием метода neighbor-joining, показывающее положение транслированных аминокислотных последовательностей гена benA Halomonas sp. D2 и ближайших последовательностей из базы данных GenBank

Заключение

В результате проведенных исследований было установлено, что штамм Halomonas sp. D2 является активным деструктором бензойной кислоты, способным осуществлять ее разложение (1 г/л) в присутствии высоких концентраций хлорида натрия (30‒70 г/л). Полученные данные указывают на возможность использования штамма при разработке технологий, направленных на очистку объектов окружающей среды от токсичных ароматических поллютантов.

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: АААА-А19-119112290008-4.