Галотолерантные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов рода Arthrobacter

2007                              Биология                      Вып. 5 (10)

ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЕ БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ РОДА ARTHROBACTER

О. В. Ястребоваa, Е. Г. Плотниковаa,b aИнститут экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 bПермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Методом накопительных культур из почв и донных отложений района солеразработок выделено пять штаммов бактерий рода Arthrobacter , способных к росту на нафталине как единственном источнике углерода и энергии при содержании 1 М NaCl в среде культивирования.

Штамм A. globiformis SF27 утилизирует фенантрен в присутствии 1 М NaCl. Установлены пути метаболизма фенантрена клетками Arthrobacter sp. B1 через образование 1,2-дигидроксинафталина, салицилата и клетками A. globiformis SF27 – через 1-гидрокси-2-нафтоат, 2-карбоксибензальдегид, орто- фталат. В штаммах A. globiformis DF14, SF27 и A. nicotianae SN17 обнаружены плазмиды размером 120 т.п.н. и 85 т.п.н.

В большинстве случаев загрязнение объектов окружающей среды в промышленных районах носит комплексный, полихимический характер. Наряду с повышенным содержанием поллютантов, к которым относятся моно- и полиароматические углеводороды (ПАУ), почвы и водоемы могут подвергаться воздействию других экстремальных факторов, в частности высокой минерализации. Возможность микробной деструкции ПАУ в данных условиях определяется устойчивостью бактерий к повышенному содержанию солей и способностью проявлять при этом биодеградативные свойства (Kästner et al., 1998; Boonchan et al., 2000).

В последние годы появляется все больше публикаций о грамотрицательных и грамположитель-ных бактериях, способных разлагать широкий спектр токсичных органических соединений различной химической природы, обладающих устойчивостью к экстремальным условиям существования, в том числе к высокой минерализации среды (Luz et al., 1997; Kästner et al., 1998). В то же время, процессы утилизации ПАУ более подробно изучены у грамотрицательных бактерий, в частности у бактерий родов Pseudomonas и Burkholderia (Yen, Serdar, 1988; Laurie, Lloyd-Jones, 1999). Имеются лишь единичные работы о подробных исследованиях биохимических путей и генетических системах разложения нафталина и фенантрена у грамположительных бактерий (Keuth, Rehm, 1991; Boldrin et al., 1993; Kanaly, Harayama, 2000).

Ранее, из образцов почв и донных отложений района солеразработок нами были выделены бактериальные культуры, отнесенные к родам Pseudomonas, Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, а также сообщества микроорганизмов, способные использовать нафталин, фенантен и бифенил в качестве единственного источника углерода и энергии (Алтынцева, 2001; Плотникова и др., 2001).

Цель исследования – изучение бактерий рода Arthrobacter, способных к деструкции нафталина и фенантрена в условиях повышенной минерализации среды.

Методы исследования

Бактериальные культуры. В работе использованы бактериальные штаммы, выделенные из почв и донных отложений, загрязненных отходами химических производств (г. Березники, Пермская область): Arthrobacter globiformis SF27, Arthrobac-ter globiformis DF14, Arthrobacter nicotianae SN17, Arthrobacter sp. B45 и Arthrobacter sp. B1 (Алтын-цева, 2001; Плотникова и др., 2001).

Среды и условия культивирования. Для роста микроорганизмов использовали минеральную среду Раймонда (Розанова, Назина, 1982) с разным содержанием хлорида натрия. В качестве полноценной среды использовали модифицированную среду Раймонда при добавлении 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта. Нафталин, фенантрен, бифенил использовали как субстраты в концентрации 1 г/л при культивировании в жидкой минеральной среде. При выращивании микроорганизмов на агаризованных средах добавляли нафталин и бифенил, которые наносили на крышку перевернутой чашки Петри. Культивирование проводили при температуре 28˚С.

Ростовые характеристики штаммов-деструкторов изучались в периодической культуре. Оптическую плотность (ОД) определяли на ФЭК-56М при длине волны 540 нм и толщине кюветы 0.5 см. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний микроорганизмов на чашках с агаризованной полноценной средой.

Плазмидную ДНК выделяли модифицированным методом щелочного лизиса (Marco et. al., 1982), методом Бабыкина (Бабыкин и др., 1984), методом Портного-Уайта (Методы общей бактериологии, 1983).

Электрофорез в агарозном геле осуществляли в соответствии с рекомендациями (Маниатис и др., 1984).

Элиминация бактериальных плазмид была выполнена согласно стандартной методике (Rheinwald et al., 1973).

Анализ метаболитов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с применением пластин Silufol UV 254 (Kavalier, Чехия) и системы растворителей гексан : этилацетат : уксусная кислота (10:3:1). Пластины анализировали под ультрафиолетом (254 нм).

Результаты и обсуждение

Характеристика бактерий-деструкторов

Выделенные из почв и донных отложений, загрязненных отходами химических и соледобывающего предприятий, 5 штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена были идентифицированы как представители рода Arthrobacter . Штаммы

SF27 (=ВКМ Ас-2063) и DF14 (=ВКМ Ас-2064) отнесены к виду " A. globiformis" , штамм SN17 (=ВКМ Ас-2065) определен как представитель вида " A. nicotianae ". Два бактериальных штамма – B1 и B45 до вида не определены (Алтынцева, 2001; Плотникова и др., 2001).

Исследуемые бактериальные культуры были проверены на способность к утилизации ряда ароматических соединений и продуктов их метаболизма. Установлено, что все штаммы растут на нафталине и салицилате. Два штамма A. globi-formis – SF27 и DF14, способные к эффективному росту на фенантрене, утилизируют возможные продукты его метаболизма – 1-гидрокси-2-нафтоат и орто -фталат, а также растут на гентизате – одном из основных метаболитов нафталина. Штамм A. nicotianae SN17 способен к росту на нафталине и его ключевых метаболитах (табл. 1).

Методом ТСХ были определены продукты метаболизма разложения нафталина и фенантрена у A. globiformis SF27 и Arthrobacter sp. В1. Установлено, что при росте на фенантрене в среде культивирования штамма A. globiformis SF27 присутствуют 1-гидрокси-2-нафтоат и два неидентифици-рованных метаболита. В среде культивирования штамма Arthrobacter sp. В1 были зафиксированы 1-гидрокси-2-нафтоат, 1,2-дигидрокси-нафталин и аналогичные неидентифицированные продукты.

При выращивании штаммов SF27, В1 и В45 на нафталине установлено, что в среде культивирования всех трех штаммов в низкой концентрации присутствует салицилат. В культуральной среде A. globiformis SF27 обнаружен также катехол, являющийся ключевым метаболитом утилизации салицилата.

Таблица 1

Штамм	Ростовые субстраты*
	Нафталин	Бифенил	Фенантрен	Салицилат	Орто -фталат	Гентизат	1H2N
DF14	+		+	+	+	+	+
SF27	+		+	+	+	+	±
SN17	+	±		+	+	+
B45	+			+
B1	+		±	+

Примечание. + – выраженный рост; ± – слабый рост; - – нет роста; 1H2N – 1-гидрокси-2-нафтоат; * рост штаммов проверяли в минеральной среде Раймонда в присутствии 0.5 М NaCl.

Характеристика бактерий-деструкторов ПАУ рода Arthrobacter

На основании полученных данных можно предположить, что утилизация нафталина штаммами SF27, В1 и В45 идет по наиболее распространенному у штаммов-деструкторов нафталина пути с образованием салицилата и катехола в качестве ключевых метаболитов и расщеплением катехола по мета- и орто-пути (рис. 1). Утилизация фенантрена штаммом B1 возможна с образо- ванием 1,2-дигидрокси-нафталина и салицилата в качестве основных метаболитов, а штаммом A. globiformis SF27 - с образованием 1-гидрокси-2-нафтоата, 2-карбоксибензальдегида и ортофталата в качестве ключевых метаболитов без участия ферментов утилизации нафталина (Kiyohara et al., 1976; Iwabuchi, Harayama, 1998).

Нафталин

Фенантрен

COOH

1-Гидрокси-

2-нафтойная кислота

1,2-дигидроксинафталин

OH

COOH

о -Фталевая кислота

COOH

COOH

Салициловая кислота

OH

OH Катехол

HO

HO

COOH

Протокатеховая кислота

орторасщепление мета расщепление орто - расщепление мета расщепление

Рис. 1. Метаболические пути биодеградации нафталина и фенантрена (Yen, Serdar, 1988; Iwabuchi, Harayama, 1998): 1 – фенантрен диоксигеназа; 2 – 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилаза; 3 – салицилат 1-гидроксилаза; 4 – о- фталат гидроксилаза

Рост бактерий-деструкторов при повышенных концентрациях хлорида натрия

Установлено, что все выделенные штаммы-деструкторы ПАУ рода Artrobacter способны к росту как на средах, не содержащих хлорид натрия, так и на средах с повышенным содержанием NaCl: до 2 М – на полноценной среде и до 1 М – на минеральной среде с нафталином в качестве субстрата. Полученные результаты позволяют отнести исследуемые штаммы к умеренно галотоле-рантным микроорганизмам, по классификации Кашнера (Кашнер, 1981).

Из литературных источников известна способность ряда грамположительных бактерий к утилизации алифатических и моноароматических со- единений в условиях повышенной минерализации среды (Luz et al., 1997). Нами изучено влияние различных концентраций NaCl на способность штамма A. globiformis SF27 к росту и деструкции фенантрена (рис. 2 А, В). Как показали результаты опыта, повышение концентрации NaCl в среде культивирования штамма SF27 до 0.4 М приводило к снижению максимального значения оптической плотности культуры по сравнению с культурой в контроле, однако количество жизнеспособных клеток культуры оставалось на уровне контроля. В присутствии 0.7 M NaCl в ростовой среде наблюдалось значительное снижение оптической плотности и количества жизнеспособных клеток культуры, а также увеличение лаг-фазы роста культуры. Повышение концентрации NaCl в среде культивирования до 1 М ингибировало рост штамма на фенантрене, однако при определении количества колониеобразующих единиц выявлены жизнеспособные клетки (рис. 2 А, В).

B

Рис. 2. Рост Arthrobacter globiformis SF27 в минеральной среде с фенантреном при разных концентрациях NaCl (М): 1 – контроль (без NaCl); 2 – 0.4 M; 3 – 0.7 M; 4 – 1 M

Влияние засоления среды на ростовые характеристики штамма Arthrobacter globiformis SF27 изучалось в сравнении со штаммом Arthrobacter globiformis КЗТ-1, выделенным из огородной почвы Подмосковья (Зайцев, Карасевич, 1981). Культивирование штаммов проводилось на среде Раймонда с добавлением триптона и дрожжевого экстракта в качестве субстратов. При увеличении концентрации NaCl в ростовой среде штамма A. globiformis SF27 до 0.4 М наблюдались более высокие значения оптической плотности культуры по сравнению с показателями, зарегистрированными при культивировании в условиях обычной минерализации (рис. 3 А, В). При концентрации 1 М NaCl максимальная оптическая плотность культуры штамма SF27 достигала уровня контроля, но за более продолжительный период. Значения оптической плотности для штамма КЗТ-1 при данной концентрации NaCl были существенно ниже, чем при выращивании в среде с обычной минерализацией. При повышении содержания NaCl в ростовой среде до 1.5 М отмечалось снижение максимальной оптической плотности культуры штамма SF27 в 2 раза, по сравнению с контролем, а также увеличение лаг-фазы. В присутствии 1.5 М NaCl в среде культивирования рост штамма Arthrobacter globiformis КЗТ1 практически отсутствовал (рис. 3 A, B).

Время, ч

Рис. 3. Рост штаммов Arthrobacter globiformis SF27 (А) и КЗТ-1 (B) в полноценной среде при разных концентрациях NaCl (M): 1 – контроль (без NaCl); 2 – 0.4 M; 3 – 0.7 M; 4 – 1 M; 5 – 1.5 M

Из полученных данных следует, что выделенный из почвы с повышенной минерализацией фе-нантрен-деградирующий штамм Arthrobacter glo-biformis SF27 способен к росту на фенантрене при концентрации NaCl в ростовой среде до 0.7 М и является более устойчивым к высокой минерализации среды, чем представитель того же вида Arth-robacter globiformis КЗТ1, выделенный из подмосковной почвы.

Ростовые характеристики штамма Arthrobacter sp. B45, выделенного из нафталинутилизирующего сообщества микроорганизмов, исследовались в минеральной среде Раймонда разной минерализации. В качестве субстрата был использован нафталин (рис. 4).

Время (ч)

Рис. 4. Рост штамма Arthrobacter globiformis B45 в минеральной среде с нафталином при разных концентрациях NaCl (М)

Опыты показали, что присутствие в среде культивирования NaCl в концентрации 0.4М приводило к небольшому увеличению значений оптической плотности культуры. В литературе описано стимулирующее воздействие небольших концентраций хлорида натрия (1-2%) на ростовые характеристики грамположительных штаммов (Плакунов и др., 1999). В присутствии 1 М NaCl наблюдалось увеличение лаг-фазы роста и снижение ростовых показателей культуры. В то же время сообщество микроорганизмов, включающее штаммы Arthrobacter sp. B45 и В1, способно к утилизации нафталина при концентрации NaCl в среде культивирования до 1.5 М (Алтынцева, 2001).

Роль плазмид в деградации ПАУ

У большинства описанных в литературе штаммов-деструкторов гены, контролирующие разложение нафталина и фенантрена, расположены в плазмидах (Кочетков, Боронин, 1984; Yen, Serdar, 1988;).

Нами был проведен анализ на наличие плаз-мидной ДНК штамма-деструктора нафталина A. nicotiane SN17 и штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена A. globiformis DF14 и SF27.

Анализ электрофореграмм показал, что штамм A. nicotiane SN17 содержит плазмиду размером около 85 тпн. В штаммах A. globiformis DF14 и SF27 зарегистрированы плазмиды размером около 120 тпн.

Известно, что способность к деструкции различных ксенобиотиков бактериями рода Arthro-bacter также часто определяется плазмидными генами (Furukawa, Chakrabarty, 1982; Eaton, 2001). В наших исследованиях при обработке клеток штамма A. globiformis SF27 митомицином С в концентрации 0.6 мкг/мл были получены элиминант-ные штаммы. Установлено, что элиминанты не способны к росту на нафталине, фенантрене и 1-гидрокси-2-нафтоате; в то же время они сохраняют способность к росту на салицилате. Полученные данные позволяют предположить, что ферменты первичной атаки ароматического кольца фенантрена и 1-гидрокси-2-нафтоата, а также ферменты утилизации нафталина до салицилата у штамма A. globiformis SF27 кодируются плазмид-ными генами.

1       2        3        4

Рис. 5. Электрофореграмма плазмидной ДНК: 1 – рSF27; 2 – рDF14; 3 – рSN17; 4 – NAH7 (83 тпн)

Заключение

Выделенные из почв и донных отложений, загрязненных отходами химических и соледобывающего производств, бактерии рода Arthrobacter имеют большой деградативный потенциал. Установлено, что все исследованные штаммы являются деструкторами нафталина и осуществляют его утилизацию по описанному в литературе для ряда штаммов рода Pseudomonas пути с образованием салицилата и катехола (Yen., Serdar, 1988). Штамм Arthrobacter globiformis SF27, вероятно, способен к деградации фенантрена через 1-гидрокси-2-нафтойную кислоту, 2-карбоксибензальдегид и орто- фталат без участия ферментов утилизации нафталина (Kiyohara, Nagao, 1976; Iwabuchi, Harayama, 1998).

Выделенные бактерии-деструкторы ПАУ рода Arthrobacter являются умеренно галотолерантны-ми бактериями (Кашнер, 1981) и способны к росту на нафталине при концентрации 1 М хлорида натрия в среде культивирования. Установлено, что все исследованные штаммы на полноценной среде способны к росту при более высоких концентрациях NaCl, чем на минеральной среде с нафталином. Из литературных данных известно, что аминокислоты могут выступать в качестве осмопротекторов и накапливаться клетками ряда галотоле-рантных штаммов при повышенном засолении среды (Galinski, 1993). Штамм Arthrobacter globiformis SF27 способен к утилизации фенантрена при концентрации NaCl до 1 М и растет при более высоких концентрациях хлорида натрия, чем штамм A. globiformis КЗТ1, выделенный из подмосковной почвы.

Три штамма SN17, SF27 и DF14 содержат плазмиды большого размера. В эксперименте по элиминации плазмиды A. globiformis SF27 получены данные, позволяющие предположить, что ферменты первичной атаки ароматического кольца фенантрена и 1 - гидрокси - 2 - нафтоата, а также ферменты утилизации нафталина до салицилата у данного штамма кодируются плазмидными генами.

На основании полученных результатов можно утверждать, что выделенные бактерии-деструкторы нафталина и фенантрена рода Arthrobacter адаптированы к росту и утилизации ароматических субстратов в условиях повышенной минерализации среды и являются перспективными для использования при биоремедиации почв и стоков с повышенным содержанием солей.

Работа поддержана грантом РФФИ-Урал №0404-96042.